7.3 Bioquímica de la fijación de nitrógeno

Ya que la fijación industrial de N₂ requiere ambos alta temperatura y presión, surge la pregunta de cómo puede sucede en células vivas creciendo a bajas temperaturas y a presión atmosférica.

La reducción biológica de N₂ a NH₃ es un proceso altamente endergónico con un mínimo requerimiento de energía de 960 kJ mol^–1 N fijado. En todos los microorganismos fijadores de N₂ los principales pasos de está reacción son los mismos (Fig. 7.2). El complejo enzimático clave, referido como nitrogenasa, es único para microorganismos fijadores de N₂ y se ha encontrado, por ejemplo, en bacterias aeróbicas y anaeróbicas, cianobacterias, y nódulos radicales de leguminosas y no leguminosas. Esta consiste de dos proteínas de hierro no hemo sensibles al oxígeno. La menor de las dos proteínas es referida como Fe–proteína, tiene una masa molecular entre 52 y 73 kDa y consiste de dos subunidades y una solo unidad Fe₄S₄ (cluster). La mayor es la FeMo –proteína con una masa molecular de aproximadamente 240 kDa, consiste de cuatro subunidades y contiene 30 átomos de Fe y 2 de Mo. Además de la forma “clásica” de nitrogenasa hay en algunas bacterias diazotróficas una nitrogenasa funcional que contiene vanadio (V) en lugar de molibdeno. Otras formas de la nitrogenasa no parecen contener ninguno de los dos elementos.

Fig. 7.2 Esquema que ilustra el suministro energético y las principales reacciones del sistema nitrogenasa. (En base a Evans & Barber, 1977.)

Para la reacción de nitrogenasa, se requiere energía en forma de ATP y equivalentes reductores (electrones) (Fig. 7.2), suministrados por respiración (ATP) y carriers de electrones, usualmente la ferredoxina (ver Capitulo 5). La nitrogenasa cataliza la reducción de varios sustratos, incluyendo el H⁺, N₂, y C₂H₂. La principal reacción para la reducción del dinitrógeno es como sigue:

N₂ + 8H⁺ + 8e^– +16Mg∙ATP → 2NH₃ + H₂ + 16Mg∙ADP + 16P_i

El actual requerimiento de ATP para la fijación de N₂ excede considerablemente los 16 mol por mol de N₂ fijado, por lo general se requiere entre 25 y 30 mol. De acuerdo a la reacción de arriba, la evolución del H₂ no es un “subproducto” de la fijación de N₂ sino que es parte de la química del ligamiento y reducción del N₂ como se muestra en mayor detalle en la Fig. 7.3. La protonación del Mo es el primer paso requerido para el ligamiento del N₂, durante el que se libera H₂. El H₂ gaseosos no es solo un inhibidor competitivo de la fijación de N₂ sino también representa una perdida neta de energía, a menos que el H₂ pueda ser reprocesado por medio de la hidrogenasa de captación (hup). Esta enzima, que se presenta ampliamente en bacterias diazotrofas aeróbicas, contiene grupos FeS y requiere níquel (Ni) para su actividad.

Fig. 7.3 Mecanismo de protonación y reducción del dinitrógeno para nitrogenasa de molibdeno. (Modificado a partir de Richards, 1991.)

Aún bajo óptimas condiciones para la fijación del N₂, en promedio 25% del flujo total de electrones que atraviesa la nitrogenasa se asigna para la formación de H₂. La hidrogenasa de captación, rompe el H₂ en 2H⁺ y 2e^–, reciclando algunos de los electrones para su subsiguiente uso en la reducción del N₂. Por lo tanto en leguminosas, la selección de cepas de Rhizobium con alta actividad hup se ha considerado como factor importante para incrementar la fijación de N₂. Posiblemente es baja la ganancia de energía al reciclar H₂, pareciendo ser la protección de la nitrogenasa tanto del oxígeno libre (O₂) como de la inhibición por H₂ las principales funciones de la hidrogenasa de captación.

La utilización de sustratos alternativos en la reacción de nitrogenasa (Fig. 7.2) ofrece una herramienta alternativa para los estudios de la actividad nitrogenasa y la fijación del N₂. El más importante en este contexto es el acetileno (C₂H₂) que es reducido por la nitrogenasa a etileno (C₂H₄) que puede medirse fácilmente en muy bajas concentraciones por cromatografía de gases. El suministrar acetileno y luego determinar la tasa de evolución del etileno (ensayo de reducción del acetileno, ARA) es un método relativamente simple y ha contribuido mucho en el pasado en la investigación de la fijación biológica de nitrógeno. La relación entre reducción de acetileno y fijación de N₂, sin embargo, no es constante y puede diferir considerablemente con la edad vegetal y particularmente entre especies de leguminosas. Además, en varias simbiosis se inhibe bastante rápidamente la actividad nitrogenasa por el acetileno. De este modo, como método indirecto el ARA es más conveniente para obtener datos relativos en vez de cuantificaciones de la tasa de fijación del N₂. Para el último propósito es mucho más apropiado el uso de ¹⁵N, particularmente si  puede resolverse el problema de una adecuada “planta de referencia” no fijadora.

La nitrogenasa es extremadamente sensible al oxigeno (O₂). Para proteger la nitrogenasa de la irreversible inactivación por O₂ in vivo, los microorganismos diazotrofos han desarrollado varias estrategias y mecanismos. Estas incluyen:

             1. Vivir bajo condiciones anaerobias (e.g., Clostridium).

           2. Proporcionar condiciones microaerofílicas en el centro enzimático mediante el consumo de la mayoría del O₂ a través de excesiva respiración i.e., protección respiratoria (e.g., Azotobacter).

            3. Vivir en colonias cubiertas por capas de baba, que eviten la difusión de O₂.

            4. Separación espacial de la nitrogenasa y los centros de fotosíntesis, i.e., evolución del O₂ (e.g., fijación de N₂ en heterocistos en cianobacterias como Anabaena).

            5. Controlar la difusión de O₂ mediante barreras mecánicas, y enzimáticamente por leghemoglobina (e.g, en los nódulos radicales de leguminosas).

            6. Enzimas detoxificadoras de especies tóxicas de oxígeno y H₂O₂ (e.g., ascorbato peroxidasa en nódulos radicales de leguminosas).

La alta demanda energética (ATP), que solo puede proporcionarse en grandes cantidades únicamente mediante respiración aeróbica, acoplada con la necesidad de proteger a la nitrogenasa del O₂ requiere un delicado sistema de regulación de  la presión de oxígeno a nivel celular. Esta regulación se realiza mejor en sistemas simbióticos y es un factor principal para su mayor efectividad en la fijación de N₂ comparando con otros sistemas.

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