7.4 Sistemas simbióticos

7.4.1 General

7.4.2 Infección y especificidad de huésped

7.4.3 Funcionamiento de los nódulos radicales, energética de la fijación del nitrógeno

7.4.4 Efectos de factores endógenos y exógenos sobre las tasas de fijación de nitrógeno

7.4.5 Efectos de otros nutrientes minerales aparte del nitrógeno

7.4.6 Efecto del nitrógeno mineral

7.4.1 General

En principio existen dos tipos de sistemas simbióticos en relación al requerido suministro de carbono para la fijación de N₂:

                        I. Leguminosas y no leguminosas noduladas

                        II. Simbiosis con cianobacteria (algas verde azuladas)

En el sistema I los microorganismos fijadores de N₂ son bien bacteria que pertenece al genero Rhizobium y Bradyrhizobium (en leguminosas), ó actinomicetos, del genero Frankia (no leguminosas, simbiosis actinorrícicas). En los trópicos y subtrópicos cerca de 200 especies vegetales forman simbiosis actinorrícicas. El sistema Casuarina en particular recientemente ha atraído mucha atención, con nódulos leñosos que pueden alcanzar un diámetro de 10 cm y más. Las casuarinas juegan un rol importante en agricultura asociada con cultivos trashumantes y reforestación de superficies terrestres erodadas.

En el sistema II las bacterias fijadoras de N₂ confían principalmente en su habilidad fotosintética para satisfacer el requerimiento de carbono (energía) para la fijación de N₂. Ejemplos del sistema II son las cianobacterias del género Nostoc que viven simbióticamente con hongos (e.g., líquenes), helechos flotantes de agua dulce del genero Azolla con cianobacterias formadoras de heterocistos del género Anabaena, ó especies leñosas del género Cycas y Macrozamia con cianobacterias que viven en raíces coraloides. En algunos casos las interacciones simbióticas entre cianobacteria y huésped invalidan una estricta clasificación entre el sistema I y II (ver arriba), i.e., microsimbiontes utilizan fotosintatos proporcionados por el huésped. Para detalles sobre los varios tipos de interacciones simbióticas el lector referirse a Werner (1987).

En sistemas de producción agrícola se ha apreciado el helecho de agua dulce Azolla en simbiosis con Anabaena azolla por su contribución al balance del nitrógeno en suelos de arrozales, que retiene en promedio de 50–80 kg N fijado por ha cada año. A partir de estudios en campo a largo plazo se han calculado aún mayores valores (79–103 kg N ha^–1 año^–1 ó 40 kg N ha^–1 en 40 días). Sin embargo, en otros sistemas de producción agrícola, los principales proveedores de N₂ son las leguminosas noduladas. Por lo tanto la siguiente discusión de sistemas simbióticos se enfoca en leguminosas donde está más avanzado el conocimiento del funcionamiento del sistema.

7.4.2 Infección y especificidad de huésped

La base inicial de nuestro entendimiento de la relación simbiótica entre las leguminosas y las especies Rhizobium fue proporcionada por Hellriegel & Wilfarth en 1888, aunque en la agricultura antigua se aprecio y hasta se explotó los efectos beneficiosos de las leguminosas sobre el crecimiento de los subsiguientes cultivos para cultivos en rotación.

Tanto en leguminosas como en leguminosas, la simbiosis se caracteriza por una más ó menos notable preferencia del huésped ó hasta especificidad de huésped. La Tabla 7.1 da ejemplos de la preferencia de huésped en el género Rhizobium y Bradyrhizobium. Por lo tanto, si se introducen leguminosas en suelos en donde no se ha cultivado previamente las mismas leguminosas ó leguminosas relacionadas simbióticamente, se requiera de inoculación seminal con la especie apropiada si se quiere conseguir la efectiva fijación de N₂. Sin embargo, dentro de una combinación dada (i.e., bacteria/planta huésped) hay grandes diferencias entre cepas bacterianas y el genotipo huésped en relación tanto de la infección, nodulación como de la efectividad en la fijación de N₂ que pueden ofrecen el potencial de incrementar la fijación de N₂, por ejemplo, mediante la selección de cepas y manipulación genética.

Dependiendo de la especie vegetal puede presentarse la infección por el microsimbionte en pelos radicales en desarrollo (e.g., en trébol), en la unión de las raíces lateral por las paredes celulares estructuralmente alteradas del cortex radical (e.g., maní, así como también en muchos sistemas actinorrícicos) ó en la base del tallo. En especies con nódulos caulinares como Sesbania rostrata la infección sucede preferentemente en lugares donde el primordio de raíz lateral puede perforar la epidermis, para que se presente la nodulación en algunas especies se requiera de inundación temporal. Los nódulos caulinares son formados básicamente por las mismas bacterias como en el caso de los nódulos radicales, y, por general, los nódulos radicales y caulinares se presentan en la misma planta. Comparando con los nódulos radicales, se deprimen menos tanto la formación como la actividad de los nódulos caulinares por altos niveles de nitrógeno mineral.

El primer paso de la infección de la planta huésped por microsimbiontes requiere el reconocimiento del huésped. Se resumen en la Fig. 7.4 los principios del reconocimiento de la planta huésped y la infección para rizobios que infectan pelos radicales (e.g., R.. leguminosarum biovar trifolii sobre Trifolium spp.). Son liberados por las raíces distintos compuestos fenólicos (flavonoides) como luteína actuando a bajas concentraciones como señal para la quimiotaxis de rizobios en la rizosfera, y a mayores concentraciones estimulan la expresión de genes de nodulación (nod) en rizobios, que han de esperarse sobre la superficie radical. Se requiere la inducción de genes nod para la producción de lectinas y el anclaje de la bacteria sobre los pelos radicales en desarrollo. El rizamiento de los pelos radicales y la división de las células corticales por “señales” bacterianas, probablemente citoquininas, son las principales características del siguiente paso que es seguido por el desarrollo del meristemo del nódulo y la invasión por los rizobios, mediado por el hilo de infección derivado de la planta huésped (Fig. 7.4). Dentro de las células en división del nódulo los rizobios son liberados hacia el citoplasma celular vegetal y empacados dentro de una membrana derivada de la planta (membrana peribacteroide). Durante ese proceso las bacterias se transforman en bacteroides que son varias veces que son varias veces más grandes que la bacteria original y están desprovistos de pared celular. Las células radicales infectadas pueden contener hasta 20000 bacteroides. La transformación a bacteroides está estrechamente relacionada con la síntesis de hemoglobina, nitrogenasa y otras enzimas requeridas para la fijación de N₂. Esta es también la etapa del desarrollo nodular que se deteriora fuertemente por la deficiencia de ciertos nutrientes minerales (Sección 7.1.5).

Fig. 7.4 Modelo de los eventos iniciales de la infección de la planta huésped por Rhizobium para un periodo de 96 h. (A partir de Djordjevic & Weinman, 1991.)

La actividad inductora de los genes nod sobre los exudados radicales y la adsorción de los rizobios en la superficie radical se afecta fuertemente  por la concentración de calcio y el pH. En el rango de concentración de 0–1.5 mм la adsorción del R. meliloti sobre Medicago sativa está linealmente relacionada con las concentraciones de calcio y magnesio, y se requieren mayores concentraciones de calcio para compensar el efecto negativo del bajo pH (i.e., altas concentraciones de H⁺) sobre la adsorción de los rizobios. De este modo, los conocidos efectos negativos del bajo pH y baja concentración de calcio sobre la nodulación de alfalfa (M. sativa) se reflejan ya en el primer paso de la nodulación. Además, en Trifolium subterraneum también es mayor la actividad inductora del gen nod sobre los exudados radicales en plantas cultivadas a mayores concentraciones de calcio.

La planta puede limitar el número de nódulos vía un proceso llamado “autorregulación” ó retroregulación por el que la formación de nódulos en una parte de la raíz inhibe la subsiguiente formación de nódulos en otras regiones de la raíz. Esta retroreacción negativa es ejercida durante el inicio de la división celular en el cortex radical, pero obviamente es ausente en mutantes “supernodulantes”. La forma del suministro de nitrógeno puede alterar el grado de autorregulación. El nitrato parece amplificar esta señal mientras que el amonio interfiere con su funcionamiento (ver Sección 7.4.5).

Dependiendo de la especie vegetal y de los factores ambientales, la fijación de N₂ comienza tan pronto entre 10 y 21 días después de la infección. Los nódulos funcionales también difieren típicamente entre especies vegetales en tamaño y forma, y pueden ser de tipo indeterminado (continuo crecimiento) ó de tipo determinado. Se presenta en la Fig. 7.5. un ejemplo de nódulos determinados e indeterminados.

Fig. 7.5 Secciones de una raíz nodulada de soya (Glycine max) con nódulos determinados (izquierda) y de Mimosa pudica L. con nódulos indeterminados alongados (derecha). (Cortesía de A. P. Hansen.)

Durante la fase retrasada entre la infección y el inicio de la fijación de N₂ la planta huésped tiene que suplir todos los nutrientes minerales, fotosintatos y aminoácidos requeridos para el crecimiento de las bacterias y del tejido nodular, sin beneficio directo para el huésped. Consecuentemente, las leguminosas también confían en un adecuado suministro combinado de nitrógeno durante este periodo (“N de arranque”) a fin de establecer un área foliar fuente lo suficientemente grande a fin de suministrar los fotosintatos y otros solutos a los nódulos en crecimiento.

7.4.3 Funcionamiento de los nódulos radicales, energética de la fijación del nitrógeno

El gran potencial de las leguminosas noduladas para la fijación del N₂ se base principalmente en tres factores, el directo suministro de fotosintatos hacia los bacteroides fijadores de N₂ en los nódulos, el efectivo mantenimiento de muy bajas concentraciones de O₂ en el interior de los nódulos para la protección de la nitrogenasa, y la rápida exportación del nitrógeno fijado (Fig. 7.6). La sacarosa es liberada por el floema hacía los nódulos donde el metabolismo del carbono y del nitrógeno está adaptado a un ambiente de limitado O₂con concentraciones de O₂ libre en el rango de 10 a 40 nм. Se consiguen por dos mecanismos las bajas concentraciones, la existencia de una barrera de difusión de O₂ en el cortex nodular, y altas tasas de respiración de los bacteroides para la producción de energía (fosforilación oxidativa). Para suministrar a los bacteroides suficiente O₂ en un ambiente limitado de O₂ se requiere la difusión finamente sincronizada de O₂, mediada por leghemoglobina (Fig. 7.6), un enzima de color rojo con un átomo central de hierro en el anillo de porfirina (idéntica a los citocromos; Sección 8.7). La concentración de la leghemoglobina está estrechamente pero no linealmente correlacionada a la capacidad fijadora de N₂ de los nódulos radicales.

Fig. 7.6 Modelo de las relaciones entre la nitrogenasa y reacciones relacionadas en bacteroides y citosol del huésped en nódulos de leguminosas.

El alto consumo nodular de O₂ para la disposición de energía también crea un gran potencial para la producción de especies tóxicas de oxigeno (Sección 5.2.2; Fig. 5.2). Esto es cierto en particular para la leghemoglobina que también está sujeta a autooxidación en donde se liberan O y H₂O₂. Para la protección contra está toxicidad, los nódulos de leguminosas contienen enzimas del ciclo glutatión–ascorbato como parte de un mecanismo de defensa (Fig. 5.2) que responde rápidamente a cambios en las concentraciones nodulares de O₂. En soya y alfalfa los nódulos efectivos contiene un capacidad considerablemente mayor para detoxificar peróxido que los nódulos inefectivos.

Más recientemente ha atraído gran interés por varías razones la variable barrera en el cortex radical externo que limita y modula la difusión de O₂ hacia los nódulos (Fig. 7.7). En esta barrera de una a cinco capas celulares en grosor los espacios intercelulares están llenos de agua. Ya que el coeficiente de difusión para O₂ en aíre es cerca de 10⁴ veces más alto que en agua, una barrera de agua en el cortex mediante la imbibición de los espacios celulares representa un muy efectivo mecanismo que limita la difusión de O₂ hacía el interior de los nódulos. En nódulos altamente activos los espacios intercelulares están principalmente llenos con aire. Sin embargo, un cambio en el estado hídrico vegetal, por ejemplo como resultado de la sequía ó defoliación, puede causar la imbibición de los espacios intercelulares con agua y, de este modo, disminuir drásticamente el suministro de O₂ para la leghemoglobina en el citosol huésped y subsiguientemente para los bacteroides (Fig. 7.7).

Fig. 7.7 Modelo del posible mecanismo de inhibición de la tasa de fijación de N₂ por limitación de O₂ para la actividad nitrogenasa. (Modificado a partir de Vessey & Waterer, 1992.)

La importación y exportación de agua en los nódulos es otro factor que afecta indirectamente la tasa de fijación del N₂. Ya que el suministro de agua hacia los nódulos está acoplado con la importación de solutos vía floemática (Sección 5.4), cualquier limitación en esta importación disminuye la presión de turgor dentro de los nódulos y por lo tanto indirectamente la permeabilidad del nódulo al O₂. La tasa de fijación del N₂ puede también limitarse por la disponibilidad de agua para la exportación xilemática desde los nódulos del nitrógeno reducido. La mayoría del agua involucrada en está exportación desde los nódulos se deriva del floema. Una disminución en la importación floemática de solutos (e.g., sombreo) presumiblemente también inhibe la exportación de nitrógeno y fijación de N₂ por limitación por agua para la exportación xilemática. Por lo tanto muchos factores ambientales que deprimen la actividad nitrogenasa pueden por lo menos en parte funcionar vía modificación tanto de las relaciones hídricas como de la barrera nodular de difusión de O₂ (Sección 7.4.4. y 7.5).

En nódulos radicales de la simbiosis Frankia la nitrogenasa está protegida del O₂ libre principalmente por paredes celulares que circundan al microsimbionte (vesículas); estas paredes celulares se adaptan a la presión ambiental del O₂ mediante la variación en grosor e incorporación de múltiples capas lipídicas.

Debido a la baja concentración de oxigeno libre en el citosol huésped de leguminosas noduladas, domina la degradación de carbohidratos por glucólisis vía oxidativa, y se sintetiza preferentemente el ácido málico como se conoce  del metabolismo del carbono en raíces de especies tolerantes a la inundación (Sección 16.4.3). El ácido málico actúa como sustrato para la síntesis reductora de ácidos carboxílicos C₄ fumarato y succinato que se transportan hacía los bacteroides para servir como sustrato energético para la nitrogenasa. Otros esqueletos de carbono a partir de la glucólisis sirven como sustratos para la asimilación del NH₃ en el citosol (Fig. 7.6).

En ciertas etapas del periodo de crecimiento nodular se pueden consumir hasta el 50% de los fotosintatos producidos por leguminosas como en fríjol caupí. Cerca de la mitad de estos fotosintatos son respirados como CO₂. Sin embargo, entre el 25 y el 30% del CO₂ respirado puede reasimilarse por lo nódulos vía PEP carboxilasa proporcionando hasta un 25% del carbono necesario para la síntesis de malato y aspartato, requeridos para la asimilación de NH₃ y su exportación hacia la planta huésped (Fig. 7.6). Para peso fresco, la actividad PEP carboxilasa nodular es entre 20 veces (arveja) y 1000 veces (soya) más alta que en las raíces.

Los costos de carbono para la fijación de N₂ varían según la especie vegetal, la cepa bacteriana y el desarrollo vegetal. Pueden incrementarse con la edad vegetal por un factor cercano a tres, por ejemplo en soya, pero permanecen casi constantes en trébol rojo. Los estimados para costos de carbono por g N fijado varían entre 12 g C a 6 g C si se incluyen los costos para el crecimiento nodular. Como valores promedio de los diferentes sistemas de leguminosas fijadoras de N₂ (e.g., que difieren en la actividad hup ó el tipo de compuesto nitrogenado exportado), 36-39% de los costos de carbono se requieren para nodulación, crecimiento nodular y respiración de mantenimiento, 42-25% para actividad nitrogenasa, y 16-22% para asimilación y exportación del NH₃. En Medicago sativa los costos de carbono varían entre 5.1 y 8.1 g C g^–1 N fijado, dependiendo de la cepa bacteriana, y se requirió cerca del 50% de estos costos para el crecimiento nodular y la respiración de mantenimiento. Asumiendo una fijación de 150 kg N ha^–1 en base a 5–8 g C g^–1 N fijado, los costos totales de carbono expresados en unidades de sacarosa estarían en el rango de 2-3 t ha^–1 que los vástagos tienen que suplir para el crecimiento y funcionamiento de los nódulos. Se refleja el alto recambio del carbono en los nódulos por el considerable requerimiento de carbono recién fijado proporcionado continuamente por el vástago, y por las casi dobles tasas de respiración por unidad peso seco raíz nodulada comparando con raíces de leguminosas no noduladas.

Aunque son bastante altos los costos de carbono para la fijación de N₂, esos costos tienen que compararse con los costos de asimilación del nitrógeno enlazado, por ejemplo, nitrato. En especies vegetales como lupino en donde el nitrato es reducido preferentemente en las raíces, se han calculado los costos del carbono en un rango similar a aquellos para la fijación del N₂. En fríjol caupí se requieren cerca de 2.3 g C por g N–NO₃ reducido, excluyendo los costos de toma de nitrato, síntesis y mantenimiento del sistema reductor, y asimilación y exportación del nitrógeno reducido. Sin embargo, en especies vegetales con reducción preferencial de nitrógeno en las hojas, son considerablemente menores estos costos (Sección 8.2.1).

El nitrógeno fijado en los bacteroides de los nódulos radicales se libera como NH₃ al citosol huésped (Fig. 7.6), únicamente por simple difusión a través de las membranas peribacteroides. En el citosol huésped el NH₃ es asimilado mediante la vía glutamina sintetasa (GS)/glutamato sintasa (GOGAT), como también es el caso para la asimilación radical y caulinar de NH₃ en el huésped (Sección 8.2.1). Las altas concentraciones de NH₃ así como los productos finales de su asimilación, la glutamina, también reprimen la actividad nitrogenasa. Esto tiene importantes implicaciones para las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados a leguminosas y otros sistemas fijadores de N₂ (Sección 7.4.6).

Generalmente, la glutamina es un compuesto nitrogenado exportado desde los nódulos solo en pequeñas cantidades (Fig. 7.8). En especies de leguminosas con nódulos indeterminados la glutamina es metabolizada en los nódulos principalmente a asparragina y liberada en el xilema hacía los vástagos. En contraste, en especies leguminosas con nódulos determinados la glutamina es metabolizada en los nódulos a ureidos alantoína y ácido alantoico (Sección. 8.2.3) y translocados en el xilema hacia el vástago.

Fig. 7.8 Incorporación de amoniaco en los solutos nitrogenados translocados en leguminosas con nódulos determinados e indeterminados. (Modificado a partir de Atkins, 1987; reimpreso con permiso de Kluwer Academia Publishers.)

7.4.4 Efectos de factores endógenos y exógenos sobre las tasas de fijación de nitrógeno

En general hay una estrecha correlación entre la tasa de fijación de N₂ y un continuo suministro de carbohidratos recién fijados hacia los nódulos radicales. Se reflejado, por ejemplo, en las fluctuaciones diurnas de las tasas de fijación de N₂. Sin embargo, estas fluctuaciones diurnas en las tasas de fijación de N₂ pueden también reflejar, por lo menos en parte, las fluctuaciones en la temperatura del suelo y las correspondientes diferencias en las tasas de difusión de O₂ hacia los nódulos.

Si plantas leguminosas noduladas se mantienen por varios días bajo baja iluminación, no solo disminuye la tasa de fijación de N₂ sino también un creciente proporción de los nódulos radicales se transforma desde el tipo funcional rojo fijador de N₂ que contiene leghemoglobina al tipo infuncional. En maní, las variaciones genotípicas en las tasas de fijación de N₂ bajo condiciones de campo fueron principalmente causadas por diferencias en la intercepción lumínica, i.e., características del dosel. Por lo tanto, en poblaciones mixtas de leguminosas y no leguminosas, la competitividad de la leguminosa esta, estrechamente relacionada con la intercepción lumínica e intensidad lumínica. Sin embargo, las especies leguminosas difieren en el tipo de respuesta a un suministro caulinar decreciente de fotosintatos, e.g., después del sombreo ó defoliación. Las plantas de maní, a diferencia de otras leguminosas, bajo estas condiciones puede mantener por tiempo más prolongado su fijación de N₂, lo que es probablemente atribuible a la presencia de fotosintatos almacenados (como cuerpos lipídicos) en los nódulos.

En leguminosas anuales de grano, aunque en menor grado en leguminosas de pasturas como trébol blanco, durante la ontogénesis se presenta un característico patrón en la tasa de fijación de N₂, como se muestra en la Fig. 7.9 para fríjol caupí. Se alcanza la máxima tasa de fijación de N₂ al inicio del periodo de floración y es seguido por un rápido descenso. Después de algún retraso, también se presenta una declinación en la tasa de fotosíntesis neta. La declinación en la tasa de fijación de N₂ al inicio de la floración es muy probablemente una expresión de la competente de demanda por fotosintatos entre las vainas en desarrollo y los nódulos radicales. La tasa de declinación en las tasas de fijación de N₂ después de la floración y cuajado de vaina depende de varios factores como las relaciones fuente–demanda (e.g., tamaño de las hojas fuente versus número de vainas; Sección 5.7) y la fuerza demanda de los nódulos. La tasa de declinación es más rápida, por ejemplo, en fríjol caupí (Fig. 7.9) que en soya, donde también existen entre cultivares notables diferencias en la tasa de declinación. De este modo los efectos beneficiosos de la aplicación tardía de fertilizante nitrogenado sobre el rendimiento de semilla en leguminosas dependen de su genotipo, siendo alto, por ejemplo, en arveja pero insignificante en haba.

Fig. 7.9 Cambios en las tasas de fotosíntesis neta y fijación de N₂ durante el crecimiento de caupí. Valores relativos. (En base a Herridge & Pate, 1977.)

La eliminación de las flores y vainas en desarrollo puede evitar está declinación en la tasas de fijación de N₂ (Tabla 5.23), si la declinación es causada por la competición de demanda por fotosintatos. Sin embargo, la presencia de frutos no deprime necesariamente y hasta puede realzar la fijación de N₂, probablemente al eliminar la retroinhibición asociada con la excesiva disponibilidad de nitrógeno fijado recientemente. Bajo condiciones de campo tales retroregulaciones frecuentemente pueden limitar las tasas de fijación de N₂ más que el suministro limitado de fotosintatos. Este tipo de retroregulación merece más atención en las actuales revisiones sobre los mecanismos de regulación de la fijación de N₂ en leguminosas.

La defoliación de leguminosas mediante el corte ó pastoreo induce una rápida y drástica declinación en la actividad nitrogenasa, perdiéndose en trébol hasta 95% en pocas horas. Sin embargo, similarmente al efecto del sombreo, también varia entre especies el efecto del corte sobre la actividad nodular, y es, por ejemplo, muy severo sobre Sesbania comparando con Leucaena. Se asume generalmente que estos efectos del sombreo y defoliación son causados por la privación de fotosintatos como fuente energética de la nitrogenasa; sin embargo puede intervenir la privación de O₂ en los nódulos ó hasta ser el principal factor regulador. Por ejemplo, después de cortar al trébol puede superarse a un alto grado la caída drástica de la actividad nitrogenasa al incrementar la concentración de O₂ ambiental en la zona de enraizado. En contraste, las elevadas concentraciones de O₂ deprimieron la actividad nitrogenasa en plantas de trébol intactas (no defoliadas). Se han encontrado en soya diferencias similares en la respuesta de la actividad nitrogenasa a elevadas concentraciones de O₂ ambiental entre plantas control completamente iluminadas y aquellas expuestas a prolongada oscuridad. Probablemente en estas diferentes respuestas al O₂ intervienen los cambios en la presión de turgor del nódulo (Sección 7.4.3). La limitación  a corto plazo del suministro floemático en particular, puede cambiar el turgor nodular y su barrera de difusión (Fig. 7.7) por lo tanto induciendo una limitación por O₂ más que limitación por carbono.

7.4.5 Efectos de otros nutrientes minerales aparte del nitrógeno

Los nutrientes minerales pueden influir en la fijación de N₂ en leguminosas y no leguminosas en varios niveles de las interacciones simbióticas: infección y desarrollo del nódulo, funcionamiento del nódulo, y crecimiento de la planta huésped. Además, pueden diferir en muchos casos el requerimiento relativo de un nutriente mineral dado para el crecimiento de la planta huésped por un lado y para el establecimiento y funcionamiento de la simbiosis por el otro. Para revisiones del tema el lector referirse a O´Hara et al (1988a), Martin (1990) y Robson & Bottomley (1991).

Un principal factor limitante en la fijación de N₂ en muchas especies de leguminosas cultivadas en suelos minerales ácidos es la inhibición de la nodulación. El incremento en el pH del suelo mediante el encalado es por lo tanto muy efectivo para incrementar el número de nódulos, por ejemplo en fríjol común ó alfalfa. Varios factores son responsables de la pobre nodulación en suelos minerales ácidos, las altas concentraciones de protones y de aluminio monomérico y en particular, las bajas concentraciones de calcio. Como se muestra en la Fig. 7.10, la formación de nódulos tiene un mucho mayor requerimiento de calcio que el crecimiento radical y caulinar de la planta huésped, e incluso que para el crecimiento de los rizobios. Experimentos adicionales han demostrado que después de la iniciación del nódulo el ulterior crecimiento adicional del nódulo no se afecta por una disminución en la concentración de calcio, indicando que solo el primer paso de la infección es altamente sensible al suministro de calcio. Como se discutió en la Sección 7.4.2, a bajas concentraciones de calcio, particularmente en combinación con altas concentraciones de protones, se deteriora la adsorción de los rizobios en la superficie radical huésped. Sin embargo, en Medicago hay también remarcables diferencias entre especies tolerantes y sensibles a condiciones ácidas con respecto a la actividad inductora de los exudados radicales de genes nod. En contraste a las especies sensibles a lo ácido, en especies tolerantes los exudados radicales liberados a bajo pH y bajas concentraciones de calcio son asimismo efectivos en inducir la actividad de genes nod, indicando un muy delicado mecanismo en la tolerancia a la acidez en especies leguminosas.

Fig. 7.10 Efecto de las concentraciones de calcio en la solución nutritiva (pH 5.0) sobre el peso fresco (●) y número de nódulos (○) en trébol subterráneo. (En base a Lowther & Loneragan, 1968.)

La pobre nodulación en suelos ácidos también es causada por la baja sobrevivencia de ciertas cepas de Rhizobium ó Bradyrhizobium, y los efectos sobre la morfología radical. La inhibición en la formación de pelos radicales por las bajas concentraciones de calcio y altas concentraciones de aluminio (Sección 16.3) y protones puede intervenir en la deteriorada nodulación en especies donde los pelos radicales son los centros dominantes de infección.

En suelos minerales ácidos, es un efecto secundario negativo la liberación neta de protones, i.e., acidificación de la rizosfera, acoplada indirectamente con la nutrición simbiótica de nitrógeno en leguminosas y no leguminosas noduladas (Sección 15.3.2). Dependiendo de la especie leguminosa, se producen entre 37 y 49 mg H⁺ por gramo de nitrógeno fijado, alcanzando una producción anual por hectárea de 4.6 kg H⁺ en trébol blanco de olor (Melilotus alba Medik) y 15.2 kg H⁺ en alfalfa. En promedio, para neutralizar la acidez formada en la producción de una tonelada de materia seca para varias especies leguminosas, se requeriría un equivalente de 80- 96 kg de cal (CaCO₃).

Se necesita un alto suministro de fósforo para la nodulación. Este requerimiento puede ser mayor que para el crecimiento radical y caulinar de la planta huésped como se mostró en la Tabla 7.2 para soya. La mínima concentración de fósforo requerida para la nodulación fue cerca de 0.5 μg P l^–1 en la solución externa. En particular, un incremento en la concentración desde 200 a 500 μg P l^–1 resulto en un mayor incremento en el peso seco nodular en relación al peso seco caulinar y, especialmente, el radical. En principal los resultados mostrados en la Tabla 7.2 fueron confirmados por Israel (1987). Con creciente suministro de fósforo se incrementó por un factor de seis el peso seco en plantas de soya, por un factor de 30 el peso nodular, se doblo la específica actividad nitrogenasa y se incremento en 70% el contenido de nitrógeno en materia seca vegetal.

Cuando leguminosas dependientes de nitrógeno simbiótico reciben un inadecuado suministro de fósforo, ellas pueden por lo tanto sufrir de deficiencia de fósforo. En soya cultivada en un suelo bajo en fósforo disponible, se obtuvo un similar incremento de rendimiento con el suministro de fertilizante mineral en las combinaciones bien de 90 kg P/ 0 kg N ó 0 kg P/120 kg N por hectárea.

Usualmente el contenido de fósforo por unidad peso seco es considerablemente mayor en nódulos que en raíces y vástagos, particularmente a bajo suministro externo de fósforo. Los nódulos por lo tanto proporcionan una fuerte demanda de fósforo. Puede diferir entre especies leguminosas la capacidad de los nódulos en desarrollo para competir con otras demandas vegetativas (meristemos radicales y caulinares) por fósforo bajo un limitado suministro externo y puede en parte ser responsable de las dudas surgidas sobre las recomendaciones de altos requerimientos específicos de fósforo para la nodulación.

En muchas especies leguminosas el alto requerimiento de fósforo para la nodulación es responsable, por lo menos en parte, de las interacciones entre la infección radical con micorrizas VA y la nodulación. La infección radical micorrícica incrementa la adquisición de fósforo en plantas cultivadas en suelos bajos en fósforo y, de este modo, puede incrementarse la nodulación bien por la aplicación de fertilizantes de fósforo ó por infecciones radicales con micorrizas (Sección 15.7.1).

Ya que el molibdeno es un componente metálico de la nitrogenasa, todos los sistemas fijadores de N₂ tienen un alto requerimiento específico de molibdeno (Capitulo 9.5). Aunque a bajo suministro, el molibdeno es transportado preferentemente hacia los nódulos, es amplia la deficiencia de nitrógeno inducida por deficiencia de molibdeno en leguminosas que dependen de fijación de N₂, particularmente en suelos minerales ácidos de trópicos húmedos y subhúmedos. Bajo estas condiciones, el peletizado de semillas ó el tratamiento del suelo con molibdeno son métodos efectivos de obtener altas tasas de fijación de N₂ en leguminosas como se muestra para maní en la Tabla 7.3. El peletizado de semillas con 100 g Mo ha^–1 incremento la actividad nitrogenasa y el contenido foliar de nitrógeno y particularmente el peso seco nódulo, mientras que el mineral nitrógeno disminuyó el peso seco nódulo y suprimió la actividad nitrogenasa comparando con plantas suplidas con solo fósforo. En la madurez las plantas suplidas con fertilizante mineral tuvieron un mayor peso seco caulinar pero un menor peso seco de vaina comparando con las plantas suplidas con molibdeno. Este bajo índice de cosecha (Sección 5.7) en las plantas fertilizadas con nitrógeno mineral fue muy probablemente el resultado del mayor consumo de agua y un más severo estrés por sequía durante el llenado de vaina temprano. De este modo, bajo ciertas condiciones ecológicas el suministro de solo 100 g Mo ha^–1 no solo pudo realzar la fijación de N₂, la toma total de nitrógeno y la tolerancia a la sequía sino también incrementar el rendimiento de vaina más que el suministro de 60 kg N ha^–1 como fertilizante mineral.

El hierro es requerido para varias enzimas clave del complejo nitrogenasa así como para el carrier de electrones la ferredoxina (Fig. 7.2) y para algunas hidrogenasas. Existe un particular alto requerimiento de hierro en leguminosas para el componente hemo de la hemoglobina. Por lo tanto, en leguminosas el hierro es requerido en mayor cantidad para la formación del nódulo que para el crecimiento de la planta huésped, por ejemplo en lupino y maní (Tabla 7.4). Aunque la deficiencia de hierro no afecta significativamente el crecimiento caulinar si deprime severamente la masa nodular y particularmente el contenido de leghemoglobina, el número de bacteroides y la actividad nitrogenasa, comparando con plantas cinco días después de su aspersión foliar de hierro. En contraste al maní, en lupino (Lupinus angustifolius) el hierro no es retranslocado hacia los nódulos después de una aspersión foliar, y se requiere el suministro directo de hierro en los centros radicales de infección para la efectiva nodulación.

 El paso crítico deteriorado por deficiencia de hierro no es la infección en sí sino la ulterior división de las células corticales, i.e., las etapas iniciales del desarrollo nodular. En especies vegetales dicotiledóneas cultivadas en suelos calcáreos, las altas concentraciones de bicarbonato no solo inducen síntomas visuales de deficiencia de hierro (clorosis) y disminución en la fotosíntesis neta sino que pueden deprimir particularmente la nodulación y la fijación de N₂ en leguminosas.

Aunque el níquel es un constituyente de una variedad de hidrogenasas de captación, y se ha encontrado una menor actividad hidrogenasa en bacteroides aislados a partir de plantas de soya deficientes en níquel, falta evidencia de que bajo condiciones de campo se deteriora la fijación de N₂ en leguminosas por la deficiencia en níquel.

El cobalto es requerido para la síntesis de leghemoglobina y, de este modo, para el crecimiento de leguminosas que dependen del nitrógeno fijado simbióticamente, el cobalto es un nutriente mineral esencial (Sección 10.4). La deficiencia de cobalto afecta el desarrollo y función del nódulo a diferentes niveles y grados (Tabla 7.5). En lupinos que dependen de la fijación simbiótica de N₂ la deficiencia de cobalto deprime el crecimiento de la planta huésped, perno no la masa nodular, que hasta se incrementa en plantas deficientes. El parámetro más sensible para la limitación por cobalto es el contenido nodular de bacteroides. Mientras que la síntesis de leghemoglobina también responde marcadamente al suministro de cobalto, fue relativamente pequeño el incremento en la actividad nitrogenasa por unidad de hemoglobina.