7.6 Microorganismos fijadores de nitrógeno de vida libre y asociativos

7.6.1 Microorganismos fijadores de nitrógeno de vida libre

7.6.2 Fijación asociativa de nitrógeno

7.6.1 Microorganismos fijadores de nitrógeno de vida libre

Las bacterias diazotróficas son ubicuas en los suelos. Ellas son bien anaeróbicas (e.g., Clostridium pasteurianum), anaeróbicas facultativas (e.g., Klebsiella) ó aeróbicas (e.g., Azotobacter y Azospirillum). Debido a la limitación por carbono (Sección 7.1), se considera muy pequeña la real contribución para la entrada de nitrógeno por estas bacterias heterótrofas de carbono, y en promedio son menos de 1 kg N ha^–1 por año. Puede incrementarse su competitividad contra otros microorganismos heterótrofos de carbono al suplir fuentes de carbono con una alta relación C/N. Por ejemplo, la incorporación de paja de trigo realza fuertemente no solo la liberación de CO₂ sino también la actividad nitrogenasa en el suelo. Las diazotrofas anaeróbicas que viven en las cavidades gastrointestinales de animales del suelo sobre materia orgánica en descomposición pueden contribuir a este incremento en la actividad nitrogenasa.

La situación es diferente para cianobacterias autótrofas de carbono (fotosintéticas) que viven en la superficie del suelo ó en aguas superficiales (campos de arroz de aniego). A partir de experimentos en campo a largo plazo en Rothamsted (UK) se ha calculado que la contribución anual de estos microorganismos al equilibrio del nitrógeno esta entre 13 y 38 kg N ha^–1. En campos de arroz de aniego se asume que las tasas de fijación de N₂ anual por cianobacterias están potencialmente entre 42 y 150 kg N ha^–1, pero se han encontrado valores reales entre 10 y 80 kg N ha^–1, dependiendo de la disponibilidad de luz y nitrógeno conjugado. Esta contribución anual por cianobacterias es mayor que la estimada para asociaciones rizosféricas en arroz (10–30 kg N ha^–1), pero menor de la estimada para la simbiosis Azolla–Anabaena (20- 100 kg N ha^–1).

Los diazotrofos de vida libre son también abundantes en superficies foliares, especialmente en hojas de plantas cultivadas en trópicos húmedos. Estos microorganismos en la filosfera (hojas del dosel) consisten de especies autótrofas de carbono (cianobacteria) y heterótrofas de carbono (e.g., Bacillus polymyxa), dependiendo la ultima de los fotosintatos percolados desde las hojas. También se presentan asociaciones entre las plantas y microbios, por ejemplo, entre cianobacterias y las hojas de ciertas especies de árboles, en que es considerable la transferencia directa del nitrógeno fijado hacia la hoja huésped y puede explicar del 20-25% del nitrógeno en el tejido foliar. Los estimados para las tasas de fijación anual por bacterias diazotróficas en la filosfera de árboles forestales están en el rango de 10- 20 kg N ha^–1 en bosques templados y hasta 90 kg N ha^–1 en bosques lluviosos tropicales.

Existe esperanza de utilizar la fijación de N₂ en la filosfera en sistemas agrícolas tropicales. La aspersión foliar de arroz de aniego varias veces con bacterias fijadoras de N₂ incrementa considerablemente la actividad nitrogenasa foliar, el rendimiento de grano, y el contenido de nitrógeno en las plantas. En arroz de aniego, y también en trigo, esto puede ahorrarse el suministrar hasta 50 kg N ha^–1 como fertilizante mineral. Sin embargo, ya que la actividad nitrogenasa se deprime fuertemente por el nitrógeno conjugado (Sección 7.4.6), solo puede esperarse en cultivos una gran contribución de este tipo de fijación de N₂ en la filosfera cuando las plantas están severamente deficientes en nitrógeno.

7.6.2 Fijación asociativa de nitrógeno

Una considerable proporción del carbono fijado durante la fotosíntesis en plantas superiores se libera en la rizosfera en la forma de exudados radicales ó células radicales en descomposición (Sección 15.4). La densidad de población de microorganismos del suelo, incluyendo bacterias diazotróficas, en la rizosfera es de este modo varías veces superior que en el suelo no rizosférico (Sección 15.5). Para casos donde las bacterias diazotróficas viven preferentemente en la superficie radical (rizoplano) y también dentro de espacios intercelulares de las células corticales, se ha introducido el término asociaciones rizosféricas. Sin embargo, no es muy clara la distinción entre diazotrofas asociativas de vida libre y las simbióticas. En contraste a la simbiosis donde la colaboración entre diferentes organismos (huésped, microbio) es mutuamente beneficiosa, en las asociaciones la amistad es más casual y es más indirecta la transferencia de nitrógeno.

Las bacterias diazotróficas también pueden encontrarse en el estele radical y caulinar de especies gramíneas donde además se multiplican. Ellas pueden aún infectar las células radicales epidérmicas y corticales, en donde por el suministro externo de nitrato no solo se conserva sino que además se deprime mucho menos su actividad nitrogenasa que en bacterias de vida libre.

Dentro de las últimas dos décadas se han identificado seis géneros de bacterias diazotróficas, que viven en asociaciones radicales, principalmente con plantas gramíneas. Los géneros más comunes en sistemas asociados son Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, y Pseudomonas. En los trópicos Azospirillum y Azotobacter parecen ser los dominantes y son bastante raros en regiones templadas, presumiblemente debido a su alta temperatura óptima que está en el rango de 30°C , independiente de su origen. En regiones templadas son más importantes los géneros Klebsiella y Enterobacter, que tienen una menor temperatura óptima.

Similarmente a los sistemas simbióticos (Sección 7.3) la nitrogenasa en diazotróficas asociativas es extremadamente sensible al oxígeno libre, y se deprime su actividad por el nitrógeno conjugado (Tabla 7.8). Con creciente suministro de nitrógeno se deprime drásticamente la actividad nitrogenasa, pero se incrementa el crecimiento caulinar de la planta huésped. Se han obtenido resultados similares con avena elatior, Arrhenatherum elatior.

Altas concentraciones de O₂ ambiental evitan casi totalmente la fijación asociativa de N₂. En maíz una disminución en la presión parcial del O₂ ambiental en la rizosfera desde 10 kPa a 2 kPa incrementó por un factor de 10las tasas de fijación, y por un factor de 20 cuando se suplió un sustrato adicional de carbono (malato). En plantas cultivadas en suelo estas condiciones microaerofílicas requeridas para la alta actividad nitrogenasa se consiguen en sistemas asociativos presumiblemente dentro de colonias en microcentros en la rizosfera, rizoplano ó cortex, y puede cambiar el óptimo de la actividad nitrogenasa a concentraciones rizosféricas mucho mayores de O₂. En arroz de aniego, existen condiciones microaerofílicas en la zona oxigenada circundante a las raíces en plantas intactas (Sección 15.3.4); la mayoría de bacterias diazotróficas en la rizosfera del arroz son especies aeróbicas.

Comparando con diazotrofos de vida libre, los diazotrofos asociativos tienen mejor acceso a los exudados radicales como sustrato energético para la actividad nitrogenasa. No obstante, estas asociaciones también están frecuentemente limitadas por carbono como se indica por las notables fluctuaciones diurnas y estaciónales en la actividad nitrogenasa. La actividad nitrogenasa es baja durante las primeras semanas del crecimiento de la planta huésped, se incrementa abruptamente en la etapa de embuchamiento, por ejemplo en cebada, y alcanza su pico en floración, por ejemplo en arroz. Sin embargo, el establecimiento y la efectividad de las asociaciones específicas dependen no solo de la cantidad sino también de la composición del sustrato de carbono. Bacterias asociativas, por ejemplo, Azospirillum prefieren ácidos carboxílicos C₄ como sustrato, particularmente el malato, lo que también es importante para la quimiotaxis en asociaciones altamente específicas como Leptochloa fusca con Azospirillum halopraeferans.

En contraste a los sistemas diazotrofos simbióticos y de vida libre, se carece de datos confiables sobre la eficiencia de la conversión energética en sistemas asociativos. En promedio, para las bacterias diazotrofas de vida libre las cifras varían entre 10 y 50 mg N fijado por gramo de carbono utilizado, y solo para Azospirillum se han encontrado cifras mayores (~92 mg N g^–1 C).

Varían ampliamente para estas asociaciones los estimados como cantidad de N fijado, desde unos pocos kilogramos a varios cientos de kilogramos por hectárea cada año. Usualmente las muy altas tasas de fijación de N₂ se obtienen a partir de estudios a corto plazo de la actividad nitrogenasa con ARA, y deben tratarse con precaución. Las mediciones del ARA son un pobre parámetro para la cuantificación de la fijación de N₂ en sistemas simbióticos (Sección 7.4) y aún menos conveniente para sistemas asociativos, donde se carece de una transferencia directa del nitrógeno fijado desde la bacteria hacia la planta huésped. Toma varios días antes de que el nitrógeno fijado en las raíces pueda detectarse en los vástagos. Para la cuantificación en plantas del nitrógeno derivado de la fijación asociativa de N₂ es apropiada la técnica de dilución isotópica ¹⁵N, hasta el momento en que se disponga de una adecuada planta referencia no asociativa (no fijadora).

En la Tabla 7.9 se dan ejemplos de estimados de la proporción de nitrógeno vegetal derivado a partir de la fijación asociativa de N₂. El rango es grande, y los valores bajos (ó cero) pueden reflejar condiciones donde, por ejemplo, fue alto el suministro de nitrógeno mineral, i.e., predominaron condiciones que inhibieron ó evitaron la fijación de N₂ (Fig. 7.11). En especies templadas, las mayoría de estudios se hicieron con trigo, bien no inoculado ó inoculado con varias especies diazotrofas, y la mayoría de datos están dentro del rango del 10% ó menor a no ser que se usen combinaciones particulares de cultivares y cepas bacterianas, por ejemplo, de Azospirillum en cultivos en materas donde hasta el 39% del nitrógeno vegetal puede derivarse de la  fijación de N₂. Sin embargo, bajo condiciones de campo en cereales (plantas C₃) cultivados en climas templados la cantidad de nitrógeno vegetal derivado a partir de la fijación asociativa de N₂ puede ser a lo sumo 5- 10 kg N ha^–1 por ciclo de cultivo. Los frecuentemente observados efectos promotores del crecimiento por inoculación con bacterias diazotrofas se atribuyen a otras causas como por ejemplo, efectos hormonales (ver abajo).

La situación es diferente, sin embargo, en caña de azúcar y pastos forrajeros C₄ en los trópicos y subtrópicos (Tabla 7.9). Ahora esta bien establecido que bajo condiciones de campo en suelos no inoculados una proporción bastante grande del nitrógeno vegetal en la caña de azúcar y pastos forrajeros C₄ se deriva de las asociaciones rizosféricas. Por ejemplo, de 31 cultivares (ecotipos) del hierba bahía (Paspalum notatum) solo uno (Batateis) produjo exudados radicales que estimularon específicamente el crecimiento de Azotobacter paspali. En Sorghum bicolor (nutans), en cultivares las diferencias por un factor de 10 en la actividad nitrogenasa estuvieron relacionadas con diferencias en las tasas de exudación radical y, presumiblemente con condiciones microaerofílicas de la rizosfera. En 25 ecotipos del Panicum maximum la proporción del nitrógeno vegetal derivado a partir de la fijación asociativa de N₂ varió entre 16% y 39%, y en un ecotipo esta proporción fue cero (Tabla 7.10).

La caña de azúcar es la especie vegetal cultivada con mayor potencial de fijación asociativa de N₂. En estudios a largo plazo con 10 cultivares de caña de azúcar entre el 60% y 80% del nitrógeno vegetal se derivo a partir de estas asociaciones, en otros estudios se han encontrado proporciones de 49-70%. Los estimados del potencial de fijación de N₂ en sistemas de cultivo de caña de azúcar están en el rango de más de 200 kg ha^–1. Estos estimados se apoyan, en principio, por la experiencia en sistemas continuos de cultivo de caña de azúcar donde se extraen 100- 200 kg N ha^–1 en cada cosecha de caña sin declinar el contenido de nitrógeno del suelo y solo con una pequeña entrada de fertilizante de nitrógeno. Puede presentarse por varías razones la particularmente alta efectividad de la fijación asociativa de N₂ en la caña de azúcar: la alta cantidad y calidad de exudados radicales (ácidos carboxílicos C₄?); las altas temperaturas del suelo y altos niveles de humedad y, de este modo, las condiciones microaerofílicas en la rizosfera; y, la más importante, la asociación con una bacteria en particular. En caña de azúcar además de Azospirillum, se ha encontrado una nueva bacteria diazotrofa Acetobacter diazotrophicus no solamente en la rizosfera sino también en el cortex radical y los tallos. La actividad nitrogenasa de esta bacteria es resistente a altas concentraciones de amonio y la bacteria se comporta como endófita, pareciendo requerir para la infección bien tejido dañado ó micorrizas VA como “carrier biológico”.

Muchas bacterias diazotróficas producen y también secretan fitohormonas como auxinas, citoquininas y giberelinas y por lo tanto realzan la excreción neta de protones en raíces de trigo y el crecimiento radical y caulinar, por ejemplo en maíz, garbanzo y Casuarina. Un ejemplo de los efectos de Azospirillum brasilense sobre la morfología radical en plantas de trigo cultivado en suelo se muestra en la Sección 14.5.3.

Estos cambios en la morfología radical inducidos por hormonas por bacterias diazotrofas pueden tener importantes consecuencias para la adquisición de nutrientes minerales escasamente solubles como fósforo (Sección 13.2), así como sobre otros microorganismos de la rizosfera, tanto en patógenos como en bacterias promotoras del crecimiento. Estos cambios producidos por efectos hormonales son muy probablemente la razón de la realzada nodulación en leguminosas después de la inoculación con Azospirillum.

Durante la última década se han conducido muchos experimentos en campo sobre el efecto de la inoculación particularmente con Azospirillum y Azotobacter sobre el crecimiento y rendimiento de varias especies de cultivo templado y tropical. Los resultados son altamente variables, pero pueden conseguirse incrementos en el rendimiento de grano hasta del 40% en trigo y cebada, 33% en millo perlado, ó 20% en sorgo por medio de la inoculación. No es claro si este incremento en el rendimiento es atribuible a la fijación del N₂, a efectos hormonales ú otros sobre el crecimiento y desarrollo. Sin embargo, hay evidencia considerable a favor de efectos hormonales, resultados de antiguos experimentos en campo para trigo lo respaldan donde un incremento en el rendimiento de grano mediante la inoculación con Azospirillum también se consiguió mediante su aplicación foliar, y fue independiente del nivel de fertilizante de nitrógeno mineral suplido.

En conclusión, las bacterias diazotrofas asociativas pueden realzar el crecimiento de la planta huésped bien por fijación de N₂ y mejorar la nutrición mineral vegetal, como por la producción de fitohormonas y por lo tanto alterar la morfología y fisiología radical así como el crecimiento radical y caulinar y procesos de desarrollo, ó por ambos. La importancia relativa de los dos componentes puede depender de muchos factores, el genotipo de una especie dada en particular (Tabla 7.10). Sin embargo, como se resumió esquemáticamente en la Fig. 7.12, son posibles algunas predicciones generales, por ejemplo, la dominancia de efectos hormonales en plantas cultivadas en climas templados y que principalmente poseen menos asociaciones rizosféricas específicas. En contraste, en pastos forrajeros C₄ y en caña de azúcar con asociaciones altamente específicas y cultivados bajo condiciones ecológicas que favorezcan la fijación asociativa de N₂ (alta temperatura del suelo y contenido hídrico, alta irradiación y exudación radical) domina el realce del crecimiento por la fijación de N₂. Los principios del patrón mostrado en la Fig. 7.12 muy probablemente no están confinados a plantas cultivadas sino también son ciertos para la vegetación natural.

Fig. 7.12 Esquema tentativo de la importancia relativa de efectos hormonales y fijación de N₂ en asociaciones entre bacterias diazotrofas y raíces vegetales.

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