8.2 Nitrógeno

8.2.1 Asimilación del nitrógeno

8.2.2 Biosíntesis de aminoácidos y proteínas

8.2.3 Rol de los compuestos orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular

8.2.4 Nutrición con amonio versus nitrato

8.2.5 Suministro, crecimiento, y composición vegetal

8.2.1 Asimilación del nitrógeno

El nitrato y el amonio son las principales fuentes de nitrógeno inorgánico tomados por las raíces de las plantas superiores. La mayoría del amonio tiene que ser incorporado en compuestos orgánicos en las raíces (ver Sección 8.2.1.2), mientras que el nitrato es rápidamente movilizado en el xilema y puede también ser almacenado en las vacuolas de las raíces, vástagos, y órganos de almacenamiento. La acumulación de nitrato en las vacuolas puede ser de considerable importancia para el balance catión-anión (Sección 2.5.3), para la osmorregulación, particularmente en las llamadas especies “nitrofílicas” como Chenopodium album y Urtica dioica y para la calidad de verduras y plantas forrajeras. Sin embargo, a fin de ser incorporado en estructuras orgánicas y cumplir sus funciones esenciales como nutriente vegetal, el nitrato tiene que ser reducido a amoníaco. La importancia de la reducción y asimilación del nitrato para la vida de la planta es similar a aquella de la reducción y asimilación del CO₂ en la fotosíntesis.

8.2.1.1 Reducción y asimilación del nitrato

Mecanismo. La reducción del nitrato en plantas superiores así como en inferiores sigue la reacción:

NO   +   8H⁺   +   8e^-   →   NH₃   +   2H₂O   +   OH^-

Algunas bacterias usan el nitrato como un aceptor de electrones bajo condiciones anaeróbicas (“respiración con nitrato”) y producen gases nitrogenados (N₂, N₂O y NO_x), un proceso que causa una perdida considerable del nitrógeno combinado en los suelos por la desnitrificación.

La reducción del nitrato a amoníaco es mediada por dos enzimas: la nitrato reductasa (NR), que involucra la reducción de dos electrones de nitrato a nitrito, y la nitrito reductasa (NiR) que transforma el nitrito a amoniaco en una reducción de seis electrones (Fig. 8.2). En plantas superiores la nitrato reductasa es un complejo enzimático que contiene dos subunidades idénticas mostrada una en la Fig. 8.2, i.e., existe como un dímero. En microorganismos pueden también presentarse tetrámeros, lo que explica las diferencias en los pesos moleculares de las nitrato reductasas entre cerca de 200 kDa y cerca de 500 kDa. Cada subunidad puede funcionar separadamente en la reducción del nitrato, y contiene tres grupos prostéticos, la flavín adenin-dinucleótido (FAD), el citocromo 557 (Cyt_c) y el cofactor de molibdeno (MoCo). El grupo prostético FADH₂ de la nitrato reductasa puede también reducir otros aceptores de electrones como el Fe(III) proporcionado como citrato ó cianuro, i.e., muestra “actividad diaforasa”. Hay, sin embargo, dudas de si la FADH ₂ de la “nitrato reductasa inducible” está involucrada en la reducción del Fe(III).

Fig. 8.2 Representación esquemática de la secuencia de asimilación del nitrato en células foliares. (En base a Beevers & Hageman, 1983 y Warner & Kleinhofs, 1992)

La nitrito reductasa es un polipéptido monomérico de cerca de 60-63 kDa que contiene un grupo prostético sirohemo. En contraste a la nitrato reductasa que está localizada en el citoplasma, la nitrito reductasa está localizada en los cloroplastos en las hojas y en los proplastidios en raíces y otros tejidos no fotosintéticos. En hojas verdes, el donador de electrones es la ferredoxina reducida, generada en la luz por el fotosistema I (Capitulo 5). En la oscuridad y particularmente en las raíces y otros tejidos no fotosintéticos una proteína similar a la ferredoxina puede hacer esta función y la energía para la producción de equivalentes reductores es proporcionada por la glicólisis.

A pesar de la separación espacial de la nitrato reductasa y la nitrito reductasa (Fig. 8.2.), por lo general, el nitrito raramente se acumula en plantas intactas bajo condiciones normales. Los nódulos radicales de leguminosas son obviamente excepciones a este control en la sincronización de la actividad de ambas enzimas (Sección 7.4.6). Ciertos herbicidas como el diuron inhiben fuerte y selectivamente la nitrito reductasa en las hojas y correspondientemente incrementan el contenido de nitritos en el tejido.

En plantas C₄, las células del mesófilo y de la vaina del haz difieren en sus funciones no solo en la asimilación de CO₂ (Sección 5.2.4) sino también en la asimilación de nitrato. Ambas, la nitrato reductasa y la nitrito reductasa están localizadas en las células del mesófilo y están ausentes en las células de la vaina del haz. Esta “división de labor” en plantas C₄, en que las células del mesófilo utilizan la energía de la luz para la reducción y asimilación del nitrato y las células de la vaina del haz para la reducción del CO2, es mas probablemente la causa de la mayor eficiencia en el uso del nitrógeno fotosintético (NUE) en las C₄ comparando con las plantas C₃. Debido al particular mecanismo de concentración de CO₂ en las células de la vaina del haz, se requiere menos concentración de RuBP carboxilasa (Rubisco) en las plantas C₄ que en las plantas C₃. En plantas C₃ el nitrógeno en la Rubisco explica el 20-30% del nitrógeno total foliar comparando con el menos del 10% en plantas C₄, más el 2-5% nitrógeno por la PEP carboxilasa en plantas C₄.

La nitrato reductasa es una enzima que es regulada mediante varios modos diferentes ejercidos en diferentes niveles, es decir, en la síntesis y degradación de la enzima, la inactivación reversible, y en la concentración del sustrato y efectores. La enzima tiene una vida media de solo unas pocas horas, y en plantas que no reciben nitrato esta simplemente ausente. La nitrato reductasa puede ser inducida en pocas horas por la adición de nitrato y ser suprimida por ciertos aminoácidos.

Como se espera la actividad nitrato reductasa es muy baja en plantas deficientes de molibdeno (Tabla 8.1). La incubación de segmentos foliares deficientes en soluciones que contienen molibdeno incrementa marcadamente la actividad de la enzima. La enzima puede aún ser reactivada in vitro si la apoenzima sin molibdeno es tratada con complejos que contengan molibdeno. Las notables diferencias entre las actividades nitrato reductasa en plantas deficientes y suficientes en molibdeno y la rápida respuesta al suministro de molibdeno pueden ser usadas para determinar el estado nutricional del molibdeno en las plantas (ver también Capitulo 12).

La alta tasa de recambio de la nitrato reductasa y la notable modulación de su actividad por efectores como la luz, nitrato, ó fitohormonas, ha iniciado muchos estudios usando a está enzima como un modelo para la regulación génica por factores ambientales en general (Sección 5.6.3) y por el nitrato en particular. El bien conocido incremento en la actividad nitrato reductasa por las citoquininas (CYT) es expresado al nivel de mRNA de nitrato reductasa que se incrementa por las CYT pero se suprime por el ABA. El nitrato no solo induce la nitrato reductasa sino también la nitrito reductasa al alterar la expresión génica principalmente al realzar la transcripción de los respectivos genes. La disminución en la eficiencia del uso de transcriptos de nitrato reductasa para la producción de la proteína nitrato reductasa es obviamente el principal factor responsable de la mucho menor actividad de la nitrato reductasa en hojas viejas comparando con las jóvenes (Fig. 8.5). La disminución en la importación de CYT hacia las hojas más viejas (Sección 5.6.5) puede estar involucrada en esta declinación en la transcripción dependiente de la edad.

Además de su función en la inducción de la síntesis de nitrato reductasa, el nitrato, junto con la luz, puede actuar como una “señal” que altera el particionamiento del flujo del carbono fotosintético en las hojas (Fig. 8.3). Para la asimilación del amoníaco hay una alta demanda de esqueletos de carbono y se puede asumir que se presenta competencia entre la síntesis de sacarosa y la síntesis de aminoácidos como se ha mostrado en hojas de tomate. El flujo de carbono entre ambas vías parece estar regulada vía proteínquinasas citosólicas que modulan la actividad de dos enzimas clave, la sacarosa-P sintasa y la PEP carboxilasa, mediante la fosforilación. El nitrato por si mismo funciona como una metabolito señal (Fig. 8.3). Sin embargo, ambas enzimas responden a la fosforilación en un modo inverso, la sacarosa-P sintasa es inactivada y la PEP carboxilasa activada, y por lo tanto hay un particionamiento de fotosintatos desde la síntesis preferencial de sacarosa hacía la síntesis de aminoácidos. Se requiere una alta actividad de PEP carboxilasa para reabastecer los ácidos tricarboxílicos proporcionados por el TCA para la asimilación del amoníaco, de acuerdo al principio mostrado para la asimilación de cationes excesivos tomados radicalmente (Sección 2.5.4).

Fig. 8.3 Modelo del NO y luz como “señales” para la fosforilación proteica y desactivación de sacarosa-P sintasa y activación de PEP carboxilasa. (Modificado de Champigny & Foyer, 1992; reimpreso con permiso de la American Society of Plant Physiologists.)

Localización en Raíces y Vástagos. En la mayoría de especies vegetales ambos raíces y vástagos son capaces de la reducción del nitrato, y las raíces pueden reducir entre un 5 y 95% del nitrato tomado. La proporción de la reducción llevada a cabo en las raíces y vástagos depende de varios factores, que incluyen el nivel del suministro de nitrato, de la especie vegetal, de la edad vegetal, y tiene importantes consecuencias para la nutrición mineral y la economía del carbono vegetal. En general, cuando el suministro externo de nitrato es bajo, una alta proporción del nitrato es reducida en las raíces. Con un suministro creciente de nitrato, la capacidad para la reducción del nitrato en las raíces se vuelve un factor limitante y una proporción creciente del nitrógeno total es translocada a los vástagos en la forma de nitrato (Fig. 8.4).

Existen notables diferencias entre especies vegetales en ambas, la proporción de nitrato reducido en las raíces y la respuesta a crecientes concentraciones externas de nitrato. Por ejemplo, a un suministro de 1 mм nitrato la proporción del nitrógeno en la savia del xilema como nitrato fue de 15% en trébol blanco (Trifolium repens), 33% en arveja (Pisum sativum) y 59% en Xanthium stumarium, y a 10 mм nitrato estas proporciones se incrementaron a 66%, 41% y 69%, respectivamente. Sin embargo, como se discutió en la Sección 3.4.4 el reciclaje del nitrógeno reducido puede ser un componente importante del nitrógeno reducido encontrado en la savia del xilema y de esta manera, el porcentaje del N total como nitrato en la savia del xilema no es un parámetro muy fiable sobre la proporción de la reducción del nitrato en la raíz. No obstante, hay un patrón general entre especies vegetales en el particionamiento de la reducción y asimilación del nitrato entre las raíces y vástagos. En especies perennes templadas como el pino marítimo ó el melocotón, así como en leguminosas anuales templadas, virtualmente todo (perennes) ó la mayoría (leguminosas) del nitrato es reducido en las raíces cuando las concentraciones externas no son muy mayores a 1 mм. En contraste, como se sugirió por Andrews (1986a), las especies anuales y perennes tropicales y subtropicales tienden a reducir una proporción bastante grande del nitrato en los vástagos, aun a bajo suministro externo, y la proporción entre la reducción radical y caulinar permanece similar con los incrementos como se incremente la concentración externa. Esta sugerencia no puede ser generalizada, sin embargo, ya que por ejemplo en plantas australianas de bosque abierto ó en plantas leñosas cultivadas en cerrado y comunidades boscosas en Brasil, por lo menos en  algunas especies de pisos inferiores y superiores la capacidad para la reducción del nitrato en las hojas es baja comparando con las raíces.

Fig. 8.4 Representación esquemática del efecto del nivel de nitrato suplido en el medio de enraizado sobre compuestos nitrogenados en savia xilemática de plantas decapitadas de guisante forrajero no inoculado (Pisum arvensis L.) (Datos recalculados a partir de Wallace & Pate, 1965).

Para una especie dada, la proporción de nitrato reducida en las raíces se incrementa con la temperatura y la edad vegetal. La tasa de toma del catión acompañante también afecta esta proporción. Con potasio como catión acompañante, es rápida la translocación a los vástagos de ambos potasio y nitrato; correspondientemente, la reducción de nitrato en las raíces es relativamente baja. En contraste, cuando el calcio ó el sodio es el catión acompañante, la reducción del nitrato en las raíces es considerablemente mayor.

El sitio preferencial de reducción del nitrato, raíces ó vástagos, puede tener un impacto importante en la economía del carbono en plantas, y probablemente también tenga consecuencias ecológicas para la adaptación vegetal a condiciones de baja y alta luminosidad. La reducción y asimilación del nitrato tiene un alto requerimiento de energía y son procesos altamente costosos cuando son llevados en las raíces (Sección 8.2.1.1). Cuando se expresa en equivalentes de ATP, este requerimiento representa 15 moles ATP para la reducción de una mol de NO y un adicional de 5 moles de ATP para la asimilación del amoniaco. En cebada, donde una alta proporción de la reducción del nitrato se presenta en las raíces, se requiere mas del 23% de la energía de la respiración radical para la absorción (5%), reducción (15%) y asimilación del nitrógeno reducido (3%), comparando con el solo 14% para la asimilación cuando es suplido el nitrógeno amonio. En contraste, para la reducción del nitrato en hojas los equivalentes de reducción pueden ser directamente proporcionados por el fotosistema I y el ATP a partir de la fosforilación. Bajo condiciones de poca iluminación ó en plantas en fructificación esto puede conducir a la competición entre la reducción de CO₂  y de nitrato. Por otro lado, bajo condiciones de alta iluminación y excesiva absorción de luz (fotoinhibición, fotooxidación; Sección 5.2.2) la reducción del nitrato en las hojas puede no solo usar las reservas de energía sino también aliviar el estrés por alta iluminación.

Edad Foliar. Durante la ontogénesis de una hoja individual, se observa un patrón típico en la actividad nitrato reductasa (Fig. 8.5). La máxima actividad se presenta cuando la tasa de expansión foliar es máxima. Después de esto, la actividad declina rápidamente. De este modo, en hojas completamente expandidas, la actividad nitrato reductasa es usualmente muy baja, y a menudo los niveles de nitrato son correspondientemente altos. Este patrón dependiente de la edad en la actividad nitrato reductasa es también típico en cultivos celulares, y las razones para esto han sido discutidas arriba. En raíces, la actividad nitrato reductasa es alta en las células en expansión de las zonas apicales y declina rápidamente hacia las zonas radicales básales.

Fig. 8.5 Curso de tiempo de la actividad nitrato reductasa y desarrollo del área foliar durante la ontogenia de la primera hoja trifoliada de soya. (Modificado a partir de Santoro & Magalhaes, 1983).

Debido a la baja movilidad del nitrato en el floema (Capitulo 3), en hojas completamente expandidas con baja actividad nitrato reductasa (Fig. 8.5), los altos contenidos de nitrato son de uso limitado para el metabolismo vegetal del nitrógeno. Además, en las células individuales el nitrato es almacenado casi exclusivamente en las vacuolas. Aunque la tasa de liberación de nitrato de las vacuolas en las células foliares se incrementa al disminuir la importación de nitrato hacia la hoja, la liberación desde la vacuola en el citoplasma puede ser un paso que limite la tasa de reducción del nitrato, y de este modo la utilización del nitrógeno nitrato almacenado en los procesos de crecimiento. La interrupción del suministro de nitrato a las raíces puede por lo tanto conducir a una caída en ambas la actividad nitrato reductasa en las hojas y en la tasa de crecimiento del vástago, a pesar de un todavía alto contenido de nitrato en el vástago. Estos resultados tienen importantes consecuencias en la sincronización del suministro de fertilizantes de nitrato.

Iluminación. En las hojas verdes existe una estrecha correlación entre la intensidad lumínica y la reducción del nitrato. Por ejemplo, hay un notable patrón diurno de reducción caulinar pero no radical (Fig. 8.6). La proporción diurna de reducción caulinar y radical del nitrato raíces por lo tanto difiere de aquella proporción nocturna.

Fig. 8.6 Acumulación del ¹⁵N reducido soluble en maíz durante un periodo de 24 h de suministro radical de ¹⁵NO₃. (En base a Pearson et al., 1981.)

La tasa de reducción foliar del nitrato es afectada por la luz en varias formas. El ritmo diurno en la reducción del nitrato (e.g., Fig. 8.6) puede reflejar las fluctuaciones en el nivel de carbohidratos y en el correspondiente suministro de equivalentes reductores y esqueletos de carbono. Sin embargo, adicionalmente a estas gruesas regulaciones existen varios mecanismos de regulación fina, al nivel de modulación enzimática mediante el particionamiento del carbono (Fig. 8.3), ó en la modulación directa de la nitrato reductasa mediante la fosforilación enzimática. En la transición luz-oscuridad esta inactivación de la nitrato reductasa se presenta en pocos minutos y, de este modo, se evita la acumulación de nitritos.

En plantas con una reducción preferencial del nitrato en las hojas, las fluctuaciones diurnas en la actividad nitrato reductasa pueden conducir a una notable disminución en el contenido de nitratos durante el periodo lumínico (Tabla 8.2). Independiente de este efecto de la luz el contenido de nitratos en los pecíolos de la espinaca como en aquellas otras especies vegetales acumuladoras de nitrato, es mayor que aquel en las láminas foliares. Las plantas cultivadas permanentemente bajo condiciones de poca iluminación (e.g., en invernaderos durante el invierno) pueden contener concentraciones de nitrato que son varias veces mayores que las de aquellas plantas cultivadas bajo condiciones de alta iluminación (e.g., en campo abierto durante el verano). Son factores adicionales el almacenamiento de equivalentes reductores y esqueletos de carbono, así como la retroregulación a partir de los aminoácidos acumulados como resultado de la baja demanda para el crecimiento. Esto es particularmente evidente en ciertas hortalizas como la espinaca y otros miembros de las Chenopodiaceae que tienen una alta preferencia para la acumulación caulinar del nitrato y que obviamente usan el nitrato en las vacuolas para la osmorregulación. En estas especies, bajo condiciones de poca iluminación, las concentraciones de nitrato en las hojas pueden alcanzar mas de 6000 mg kg^-1 peso fresco, esto es, ~100 mм. Bajo estas condiciones de poca iluminación el nitrato puede reemplazar completamente a los azucares en su función osmótica, y lo mismo es cierto para la compensación del nitrato por el cloruro.

Asimilación y Osmorregulación del Nitrato. En aquellas especies vegetales donde la mayoría ó toda la asimilación del nitrato se presenta en los vástagos, los aniones ácidos orgánicos son sintetizados en el citoplasma y almacenados en la vacuola (Fig. 8.7) a fin de mantener ambos el balance catión-anión y el pH intracelular. Esto puede conducir a problemas osmóticos si la reducción del nitrato fuera a continuar después de concluir la expansión celular foliar. Sin embargo, existen varios mecanismos para la eliminación del exceso de solutos osmóticos del tejido caulinar

:

            1. La precipitación de los excesos de soluto en una forma no activa osmóticamente. Son comunes en plantas la síntesis de ácido oxálico para una compensación de cargas en la reducción y precipitación del nitrato como oxalato de calcio, que incluyen a la remolacha azucarera.

            2. La retranslocación del nitrógeno reducido (aminoácidos y amidas) junto con los cationes móviles del floema, como el potasio y magnesio, a áreas de nuevo crecimiento.

            3. La retranslocación a las raíces de aniones ácidos orgánicos, preferentemente malato, junto con el potasio y la liberación de un anión (OH^– ó HCO ) después de la descarboxilación. En el intercambio de los aniones liberados, el nitrato puede ser tomado sin los cationes, debido a que el potasio endógeno actúa como contraión en el transporte a larga distancia, un mecanismo discutido en el Capitulo 3 (Fig. 3.12).

Fig. 8.7 Modelo de asimilación caulinar del nitrato.

8.2.1.2 Asimilación del amonio

Mientras que el nitrato puede ser almacenado en las vacuolas sin efectos perjudiciales, el amonio y en particular su equilibrio junto con el amoniaco

NH₃ (disuelto en agua)    ⇌   NH    +   OH^-

son tóxicos a concentraciones bastante bajas. La formación de aminoácidos, amidas y compuestos relacionados es la principal vía de detoxificación de cualquiera de los iones amonio tomados por las raíces ó del amoniaco derivado de la reducción del nitrato ó de la fijación del N₂. Mientras que las concentraciones de amonio (NH ) en el citoplasma están usualmente debajo de 15 µм hay evidencia de que cantidades considerables de amonio pueden ser almacenadas en las vacuolas donde el bajo pH evita la formación de amoniaco.

Los principales pasos en la asimilación de iones amonio suplidos a las raíces son la toma por las células radicales y la incorporación en aminoácidos y amidas con una liberación simultanea de protones para la compensación de carga (Fig. 8.8). Se ha discutido como un modelo alternativo la infiltración del amoniaco a través de la membrana plasmática, presentándose la liberación de protones antes de la infiltración. Ya que los vástagos tienen una capacidad bastante limitada para la eliminación de protones, casi todo el amonio tomado tiene que ser asimilado en las raíces, y el nitrógeno asimilado es transportado en el xilema como aminoácidos  y amidas hacia el vástago (Fig. 8.8). En algunas especies vegetales, como el arroz de aniego, una proporción considerable del amonio (NH ) puede ser transportado a, y asimilado en, los vástagos.

Fig. 8.8 Modelo de asimilación radical del amonio.

La asimilación radical del amonio también tiene un gran requerimiento de esqueletos de carbono para la síntesis de aminoácidos. Estos esqueletos de carbono son proporcionados por el ciclo de los ácido tricarboxílicos (TCA), y los intermediarios removidos tienen que ser reabastecidos por la incrementada actividad PEP carboxilasa (Fig. 8.8). Con el suministro de N-NH₄ comparando con N-NO₃ la fijación neta de carbono en las raíces es hasta tres veces mayor en arroz y tomate y cerca de cinco veces mayor en maíz. Los principios de esta “fijación oscura” de CO₂ se han discutido en conexión con la toma excesiva de cationes (Fig. 2.20), con la fijación de N₂ en leguminosas noduladas (Fig. 7.6) y con la asimilación del nitrato (Fig. 8.7).

A fin de minimizar los costos de carbono para el transporte de la raíz al vástago, el grueso del nitrógeno asimilado en las raíces es transportado en la forma de compuestos ricos en nitrógeno con relaciones de N/C > 0.4. Uno, raramente dos ó más, de los siguientes compuestos dominan en el exudado del xilema radical: las amidas glutamina (2N/5C) y asparragina (2N/4C); el aminoácido arginina (4N/6C); y los ureidos alantoína y ácido alantoico (4N/4C). De acuerdo con este modelo de la economía del carbono, en el transporte en el floema a los frutos en desarrollo, que son demandas no fotosintéticas, los aminoácidos con una relación > 0.4 son las predominantes formas de transporte del nitrógeno.

Los compuestos orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular usados predominantemente para el transporte a larga distancia ó para el almacenamiento en células individuales difieren entre familias vegetales (Tabla 8.3). En leguminosas en general y en soya en particular, la mayoría del nitrógeno fijado transportado desde el xilema de las raíces noduladas es incorporado en los ureidos alantoína y ácido alantoico.

A pesar de los diferentes sitios de asimilación del amoniaco (raíces, nódulos radicales, y hojas) las enzimas clave involucradas son en cada caso la glutamina sintetasa y la glutamato sintasa (Fig. 8.9). Ambas enzimas se han encontrado en raíces, en cloroplastos, y en microorganismos fijadores de N₂, y la asimilación de la mayoría si no todo el amoniaco derivado de la toma de amonio, de la fijación de N₂, de la reducción del nitrato, y de la fotorrespiración (Capitulo 5) es mediada por la vía de la glutamina sintetasa-glutamato sintasa.

En está vía el aminoácido glutamato actúa como el aceptor para el amoniaco, y se forma la amida glutamina (Fig. 8.9). La glutamina sintetasa tiene una muy alta afinidad por el amoniaco (bajo valor K_m) y de este modo es capaz de incorporar amoniaco aún si está presente a concentraciones muy bajas. La glutamina sintetasa es activada por un alto pH y por altas concentraciones de ambos magnesio y ATP, y todos estos tres factores se incrementan en el estroma del cloroplasto bajo iluminación (ver Sección 8.5.4).

Fig. 8.9 Modelo de vía de asimilación del amoniaco (1,2) vía de la glutamina sintetasa-glutamato sintasa, con bajo suministro de NH₃ (1) y con alto suministro de NH₃ (2). (3) vía de la glutamato deshidrogenasa. GOGAT, glutamina-oxoglutarato aminotransferasa.

En cloroplastos, la reducción del nitrato estimulada por la luz y la realzada asimilación de amoniaco están eficientemente coordinados a través de la importación del 2-oxoglutarato desde el estroma y la exportación del glutamato desde el estroma de los cloroplastos al citoplasma. Se requiere una coordinación eficiente para evitar altos niveles de amoniaco que pueden desacoplar la fotofosforilación. La toxicidad por amoniaco puede estar relacionada con la rápida infiltración del amoniaco a través de las biomembranas. Por ejemplo, el amoniaco, pero no el amonio (NH ), se difunde rápidamente a través de las membranas exteriores de los cloroplastos.

La otra enzima en la asimilación del amoniaco, la glutamato sintasa (GOGAT), cataliza la transferencia del grupo amida (NH₂) desde la glutamina al 2-oxoglutarato, que es un producto del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Fig. 8.9): Para esta reacción se requiere cualquiera la ferredoxina reducida (del fotosistema I) ó el NAD(P)H (de la respiración). La reacción resulta en la producción de dos moléculas de glutamato, de las cuales una es requerida para el mantenimiento del ciclo de asimilación del amoniaco y la otra puede ser transportada desde los sitios de asimilación y utilizada en cualquier parte para la biosíntesis de proteínas, por ejemplo. Como una alternativa, cuando el suministro de amoniaco es grande, ambas moléculas de glutamato pueden actuar como un aceptor del amoniaco,  y una molecula de glutamina abandona el ciclo (vía (2). Fig. 8.9)

Otra enzima, la glutamina deshidrogenasa (Fig. 8.9) que tiene una baja afinidad por el amoniaco (alto valor K_m), solo se vuelve importante en la asimilación del amoniaco a un muy alto suministro de amonio en combinación con el bajo pH de la solución nutritiva, relacionado con los altos contenidos de amoniaco libre en el tejido radical.

8.2.2 Biosíntesis de aminoácidos y proteínas

El nitrógeno enlazado orgánicamente del glutamato y la glutamina puede ser usado para la síntesis de otras amidas, así como de ureidos, aminoácidos, péptidos,  y péptidos de altos peso molecular como las proteínas. Aunque las plantas pueden contener hasta 200 diferentes aminoácidos, solo cerca de 20 de ellos son requeridos para la síntesis de proteínas. La cadena peptídica de cada proteína tiene una secuencia de aminoácidos genéticamente fija. Los esqueletos de carbono para estos diferentes aminoácidos son derivados principalmente de intermediarios de la fotosíntesis, glucólisis, y del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. (Fig. 8.10).

Fig. 8.10 Biosíntesis de aminoácidos a partir de varios intermediarios del ciclo de Calvin, glucólisis y ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA).

La transferencia de grupos amino desde aminoácidos a otros esqueletos de carbono -la reacción de transaminación- es catalizada por aminotransferasas, que son también referidas como transaminasas:

El grupo prostético de las transaminasas es el piridoxal fosfato, un derivado de la vitamina B₆. Las plantas superiores contienen un juego completo de transaminasas capaces de lanzar grupos aminos entre los aceptores apropiados. Los animales monogástricos y los humanos dependen de un suministro externo en la dieta de ambos el grupo prostético de la transaminasa (i.e., de la vitamina B₆) y ciertos aminoácidos que no pueden ser sintetizados y que por lo tanto son “esenciales” en la dieta (e.g., valina, leucina, lisina, metionina, y triptófano).

En la síntesis proteica los aminoácidos individuales son acoplados por enlaces peptídicos (R₁-CO-NH-R₂) en una reacción de condensación:

Las proteínas son polipéptidos formados a partir de más de 100 aminoácidos individuales, y su secuencia es determinada por la información genética llevada por moléculas de doble hebra (Fig. 8.11). La expresión de la información genética inicia en el núcleo de la célula con la síntesis de un ácido ribonucleico mensajero (mRNA) que es una copia de una hebra de un fragmento activado de DNA (transcripción). El mRNA se difunde en el citoplasma y se adhiere a los ribosomas, las “fabricas” en la biosíntesis de proteínas. Por sus distintas estructuras espaciales los ribosomas permiten a dos moléculas de aminoacíl-tRNA ligarse al mRNA de acuerdo con su codon en la punta. Ahora los dos residuos aminoácidos están en posición para ser ligados enzimáticamente mediante la formación de un enlace peptídico. Subsecuentemente, los ribosomas se mueven a lo largo del mRNA, liberando el primer tRNA y permitiendo que el siguiente aminoacíl-tRNA se ligue al mRNA resultando en la elongación del péptido. Este proceso de translocación se termina cuando el ribosoma alcanza la señal stop que demanda su rompimiento y la liberación de la cadena peptídica. Los nutrientes minerales tienen un rol importante en estos procesos. El mantenimiento de la altamente organizada estructura del ribosoma requiere de cationes divalentes, Mg²⁺ en particular. El magnesio también es necesario para la activación de los aminoácidos por el ATP, y el potasio está involucrado en el paso de la elongación de la cadena. El zinc es el componente metálico de la RNA polimerasa, y el hierro es requerido en algún modo para la integridad del ribosoma.  Estos efectos de los nutrientes minerales individuales son discutidos en mayor detalle en las secciones posteriores.

Fig. 9.11 Principales pasos de la biosíntesis proteica.

La síntesis y degradación de las proteínas se presentan simultáneamente en las células y tejidos. Las tasas de recambio de las proteínas, i.e., su vida media, difieren ampliamente, desde unas pocas horas a varios días y semanas. Se encuentran particularmente altas tasas de recambio en algunas proteínas enzimáticas, por ejemplo, la nitrato reductasa y la proteína D1 en el fotosistema II (Sección 5.2.2). Para una proteína dada, la tasa de síntesis y degradación son fuertemente moduladas por factores endógenos y exógenos, que incluyen la etapa de desarrollo (e.g., edad foliar), ó a las fitohormonas como componentes que transmiten “señales” ambientales al nivel de expresión génica y síntesis de proteínas (Sección 5.6; Fig. 5.17) Los nutrientes minerales tienen una fuerte influencia en ambas la síntesis y degradación, cualquiera directamente (e.g., como un componente de la enzima) ó indirectamente vía al alterar la estructura de la membrana y, de este modo, la compartimentación (e-g., calcio) ó el equilibrio de las fitohormonas, lo que es particularmente cierto para el nitrógeno.

8.2.3 Rol de los compuestos orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular

En plantas superiores los compuestos orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular (Fig. 8.12) no solo actúan como intermediarios entre la asimilación del nitrógeno orgánico y la síntesis -ó degradación- de compuestos de alto peso molecular. Ellos también son importantes por otras varias razones como se muestra en los siguientes ejemplos. En contraste con las plantas inferiores, animales, y humanos, las plantas superiores no son capaces de excretar cantidades considerables de nitrógeno enlazado orgánicamente, por ejemplo, como la urea. Aunque las plantas pueden almacenar grandes cantidades de nitrato, ellas no son capaces de reoxidar el nitrógeno enlazado orgánicamente a nitrato, el que podría ser una forma segura de almacenamiento, por ejemplo, en periodos de una realzada degradación proteica (e.g., hojas senescentes). De los compuestos de nitrógeno de bajo peso molecular principalmente los aminoácidos y las amidas sirven a la función como buffer y almacenamiento transitorio, además de sus funciones en el transporte a larga distancia del nitrógeno reducido.

Fig. 8.12 Principales clases de compuestos nitrogenados en plantas.

En contraste a los aminoácidos y amidas, los ureidos alantoína y alantoato (ácido alantoico) sirven principalmente en la función del transporte del nitrógeno fijado en los nódulos radicales de ciertas especies leguminosas como la soya (Fig. 7.8). Todavía no es claro si los ureidos son también sintetizados en las raíces y hojas de leguminosas no noduladas. En los vástagos, la mayoría de los ureidos son degradados en las hojas y solo una pequeña proporción es directamente transportada a las vainas en desarrollo y degradados ahí antes de ser transportados a los cotiledones. Las vías de degradación de los ureidos son mostradas en la Fig. 8.13. En soya la liberación de amoniaco y de CO₂ a partir de la degradación de los ureidos sucede sin la participación de la urea como un intermediario, i.e., vía alantoato amidohidrolasa (Fig. 8.13). Puede por lo tanto no esperarse un alto requerimiento de níquel como un componente metálico de la ureasa (Sección 9.5) en leguminosas noduladas transportadoras de ureidos.

Fig. 8.13 Vía de degradación caulinar de los ureidos alantoína y alantoato en soya nodulada. (Modificado a partir de Winkler et al., 1988; reimpreso con permiso de Trends in Biochemical Sciences.)

Fig. 8.14 Vía de la síntesis de poliaminas. (Modificado de Evans & Malmberg, 1989).

Otra clase importante de compuestos orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular son las aminas y poliaminas, siendo su biosíntesis mediada por la descarboxilación de aminoácidos. Las aminas son componentes de la fracción lipídica de las biomembranas (Sección 2.3), el componente amino etanolamina, por ejemplo, es sintetizado mediante la descarboxilación del aminoácido serina. Más recientemente las poliaminas han atraído la atención como mensajeros secundarios (Sección 5.6.3) y en la protección de membranas. En plantas el aminoácido arginina es el principal precursor de la síntesis de poliaminas (Fig. 8.14). La putrescina que es usualmente la poliamina dominante en las plantas, puede constituir mas del 1.2% de la materia seca vegetal. El contenido de poliaminas es particularmente alto en tejidos meristemáticos, en plantas suplidas con altos niveles de amonio, y bajo deficiencia de potasio (Sección 8.7).

Las poliaminas parecen hacer muchas funciones en las plantas, cualquiera en forma libre ó enlazada, por ejemplo con varios fenólicos. Ellas están causalmente involucradas en la división celular, embriogénesis, e iniciación y desarrollo floral, un ejemplo de lo ultimo ha sido dado en la Tabla 6.3. Las poliaminas son bastante efectivas en retrasar la senescencia de las hojas al inhibir la actividad de las proteinasas ácidas. Las poliaminas están también potencialmente involucradas en la biosíntesis de etileno (Fig. 8.14). Muchos de los efectos y funciones de las poliaminas, que incluyen la inhibición de la síntesis de etileno están probablemente relacionados con su capacidad para actuar como eliminadores de radicales libres de oxígeno e inhibir por lo tanto la peroxidación de las lípidos de las membranas (Sección 2.3) y, de este modo, estabilizan las biomembranas.

Otro compuesto orgánico nitrogenado de bajo peso molecular importante para la estabilización de las estructuras celulares y la osmorregulación es la betaína (también referida como glicina betaína, Tabla 8.3). Bajo estrés por salinidad ó por sequía, son muy realzadas la síntesis de betaína y su acumulación particularmente en el citoplasma donde esta actúa como un “soluto compatible” al contrarrestar la perturbación osmótica causada por las altas concentraciones vacuolares de iones inorgánicos como el cloruro y el sodio, que son incompatibles con el metabolismo citoplasmático. La glicina betaína protege a las enzimas de la inactivación por las altas concentraciones de NaCl (Fig. 16.24) y a las membranas contra la desestabilización por el calor. Los compuestos orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular son por lo tanto importantes para la adaptación vegetal a sustratos salinos (Sección 16.6).

En respuesta a la exposición vegetal a altas concentraciones de ciertos metales pesados, cadmio en particular, se induce la síntesis de polipéptidos que tienen un muy alto contenido del aminoácido cisteína que contiene azufre y que se ligan a grandes cantidades de metales pesados. Estas “fitoquelatinas” pueden jugar un rol importante en la detoxificación de metales pesados (Sección 8.3).

Los péptidos han sido también considerados en estar involucrados en el trasporte a larga distancia de metales pesados en el xilema. Sin embargo, la mayoría de los metales pesados en el xilema están presumiblemente presentes cualquiera como cationes libres ó complejados con ácidos orgánicos. El cobre es una excepción, este es transportado en el xilema exclusivamente en forma complejada, mas probablement