9.3 Cobre 

9.3.1 General

9.3.2 Proteínas de cobre

9.3.3 Carbohidratos, lípidos y metabolismo del nitrógeno

9.3.4 Lignificación

9.3.5 Formación del Polen y Fertilización

9.3.6 Deficiencia y toxicidad por cobre

9.3.1 General

El cobre es un elemento de transición y comparte semejanzas con el hierro, como la formación de complejos altamente estables y fácil transmisor de electrones:

+e^-

Cu²⁺   ⇌   Cu⁺

-e^-

El cobre divalente es rápidamente reducido a cobre monovalente, que es inestable. La mayoría de funciones del cobre como nutriente vegetal se basan en la participación del cobre enlazado enzimáticamente en las reacciones redox. En las reacciones redox de las oxidasas terminales las enzimas de cobre reaccionan directamente con el oxigeno molecular. La oxidación terminal en células vivas es por lo tanto catalizada por el cobre y no por el hierro.

El cobre tiene una alta afinidad por péptidos y grupos sulfhidrilo, y de este modo, por proteínas ricas en cisteína en particular, así como por grupos carboxílicos y fenólicos. Por lo tanto, en la solución del suelo así como en las raíces (savia exprimida) y en la savia del xilema, más del 98-99% del cobre está presente en forma complejada. Es más probablemente también el caso en el citoplasma y sus organelos donde la concentración de Cu²⁺ y Cu⁺ es extremadamente baja.

9.3.2 Proteínas de cobre

De acuerdo a Sandmann & Böger (1983) existen tres diferentes formas de proteínas en que el cobre es el componente metálico (proteínas de Cu): (a) proteínas azules sin actividad oxidasa (e.g., plastocianina), que funcionan en la transferencia de un electrón; (b) proteínas no azules, que representan a las peroxidasas y oxidan monofenoles a difenoles; y (c) proteínas multicobre que contienen por lo menos cuatro átomos de cobre por molécula, que actúan como oxidasas (e.g., ascorbato oxidasa y difenol oxidasa) y catalizan la reacción:

2AH₂   +   O2   →   2A   +   2H₂O

La citocromo oxidasa es una proteína mixta de cobre-hierro que cataliza la oxidación terminal en las mitocondrias (Sección 9.1.2).

Bajo deficiencia de cobre se disminuye bastante rápidamente la actividad de estas enzimas de cobre, y en la mayoría, pero no en todos los casos (Sección 9.3.2.3) estas disminuciones están correlacionadas con notables cambios metabólicos e inhibición del crecimiento vegetal.

9.3.2.1 Plastocianina

En general, más del 50% del cobre localizado en los cloroplastos está enlazado a la plastocianina. Esta proteína de Cu tiene un peso molécula de ~10 kDa y contiene un átomo de cobre por molécula. La plastocianina es un componente de la cadena de transporte de electrones del fotosistema I (Fig. 5.1). Parece ser generalmente una proporción de 3 a 4 moléculas de plastocianina por 1000 moléculas de clorofila.

Bajo deficiencia de cobre hay una estrecha relación entre el contenido foliar de cobre y el contenido de plastocianina y, de este modo, con la actividad del PS I mientras que solo se afecta ligeramente el contenido de clorofila (Tabla 9.9).

Comparando con el PS I, la actividad del PS II es usualmente menos deprimida por la deficiencia de cobre (Tabla 9.10): Las menores actividades del PS II en plantas deficientes de cobre están relacionadas con otras funciones del cobre en los cloroplastos. El cobre es un componente de otras enzimas del cloroplasto (ver abajo) y es requerido para la síntesis de quinonas; la disminución en plastoquinonas en los cloroplastos (Tabla 9.10) puede reflejar esta función del cobre. En cloroplastos deficientes de cobre la inhibición del transporte de electrones se acentúa adicionalmente por la falta de dos polipéptidos en la membrana cloroplástica, que son probablemente necesarios para mantener la fluidez apropiada de la membrana que asegure la movilidad de las moléculas de plastoquinona para el transporte de electrones entre los dos fotosistemas.

9.3.2.2 Superóxido dismutasa

Los varios tipos de isoenzimas SOD y su requerimiento para la detoxificación de los radicales superóxido (O ) se han discutido en la Sección 9.2. La SOD zinc-cobre (CuZnSOD) tiene un peso molecular de ~32 kDa, y en el sitio activo probablemente un átomo de cobre y uno de zinc están estrechamente conectados mediante un nitrógeno histidina común. El átomo de cobre en la CuZnSOD está directamente involucrado en el mecanismo de detoxificación del O generado en la fotosíntesis.

La CuZnSOD está localizada en el citoplasma, en la mitocondria y en los glioxisomas, pero se presenta también en los cloroplastos, junto con la FeSOD (Sección 9.1). En los glioxisomas la CuZnSOD está presumiblemente involucrada en el control de la peroxidación de los lípidos de membrana y, de este modo, en la senescencia.

Bajo deficiencia de cobre, también declina drásticamente la actividad foliar de CuZnSOD (Tabla 9.9). Esta declinación es cierta para ambas, la CuZnSOD cloroplástica y citosólica, y es acompañada por un correspondiente incremento simultáneo en la actividad de la MnSOD. Ya que la MnSOD está localizada exclusivamente en el citoplasma (Sección 9.2), hay por lo menos en este compartimiento un mecanismo de compensación coordinado para la formación de isoenzimas SOD. No se sabe si este es también el caso para una correspondiente compensación de la CuZnSOD por la FeSOD en los cloroplastos. Los dramáticos cambios en la ultraestructura de los cloroplastos con deficiencia severa de cobre (desintegración de la lamela intergrana e hinchamiento de los granas apilados) son típicos del daño oxidativo y mas probablemente indicativos de la inadecuada detoxificación del O en cloroplastos deficientes de cobre.

9.3.2.3 Citocromo oxidasa

Esta oxidasa terminal de la cadena de transporte de electrones en la mitocondria (Fig. 5.5) contiene dos átomos de cobre y dos átomos de hierro en la configuración hemo. La actividad de la enzima puede ser bloqueada por el cianuro; el remanente consumo respiratorio celular de O₂ es luego mediado por la quinol oxidasa conocida como “oxidasa alternativa” (en la “vía alternativa”, ver Sección 5.3). Esta enzima contiene cobre pero no hierro hemo. Es por lo tanto improbable que en células deficientes de cobre pueda funcionar la respiración alternativa para compensar la baja actividad citocromo oxidasa. Ya que las tasas de respiración cualquiera permanezcan sin afectarse ó se disminuyen solo moderadamente por la deficiencia de cobre, la citocromo oxidasa parece estar presente en gran exceso en la mitocondria.

9.3.2.4 Ascorbato oxidasa

La ascorbato oxidasa cataliza la oxidación del ácido ascórbico a ácido dehidroascórbico de acuerdo a la ecuación:

La enzima contiene por lo menor cuatro átomos de carbono por molécula que operan una reducción de cuatro electrones del O₂ a agua. Esta enzima se presenta en las paredes celulares y el citoplasma, y puede actuar como una oxidasa terminal respiratoria, como se mostró arriba, ó en combinación con polifenol oxidasas (Sección 9.3.2.6). La actividad de la ascorbato oxidasa se disminuye en plantas deficientes de cobre (Tabla 9.9) y es una indicadora sensible del estado nutricional del cobre en la planta (Fig. 9.10). Aunque en este caso no se encontró relación directa entre una disminución en la actividad enzimática y el crecimiento vegetal, hay una estrecha correlación positiva en el rango de concentración subóptimo entre el contenido de cobre en el tejido foliar y su actividad ascorbato oxidasa (Fig. 9.10).

Fig. 9.10 Relación entre el suministro de cobre, peso seco caulinar, actividad ascorbato oxidasa, y contenido de cobre en trébol subterráneo. (Modificado a partir de Loneragan et al., 1982a)

En base a esta correlación se ha desarrollado una rápida y sencilla prueba colorimétrica de campo para la actividad ascorbato peroxidasa para el diagnóstico de la deficiencia de cobre. Los resultados de esta prueba están estrechamente de acuerdo con el diagnóstico basado en el análisis químico del contenido foliar  de cobre.

El resuministro de cobre a las plantas deficientes puede reestablecer la actividad ascorbato oxidasa solo en hojas muy jóvenes, pero no en hojas maduras (Tabla 9.11), sugiriendo que la bioenzima activa solo puede ser sintetizada en las laminas foliares durante su desarrollo muy inicial. Esto contrasta plastocianina cuya actividad puede también ser restaurada en hojas maduras con el resuministro de cobre.

9.3.2.5 Diamina oxidasa

Las poliamino oxidasas son flavoproteínas que catalizan la degradación de las poliaminas como por ejemplo la espermidina (Sección 9.2) para formar putrescina, H₂O₂ y NH₃. Las poliamino oxidasas degradan preferentemente tri- y tetra-aminas que son las principales formas presentes en especies gramíneas. La degradación de la putrescina (diamina) y, en algun grado de espermidina (triamina), es mediada por la diamina oxidasa, una enzima que contiene cobre. La diamina oxidasa está difundida en diferentes especies vegetales, particularmente en leguminosas. Su actividad disminuye en plantas deficientes de cobre (Tabla 9.9) y puede ser restaura al resuministrar cobre. Similarmente a la ascorbato oxidasa (Tabla 9.11), la restauración de su actividad esta confinada a hojas muy jóvenes. En hojas deficientes de cobre se ausenta la apoenzima de la diamina oxidasa, siendo el cobre obviamente requerido para modular el nivel de mRNA que codifica la enzima. Este último proceso esta confinado a etapas muy tempranas del desarrollo foliar.

La diamina oxidasa está principalmente localizada en el apoplasto de la epidermis y el xilema de tejidos maduros donde está funciona presumiblemente como un sistema de entrega de H₂O₂ a la actividad peroxidasa en el proceso de lignificación y suberización. De acuerdo con esto, la actividad diamina oxidasa se incrementa en respuesta a lesiones y está estrechamente correlacionada con la lignificación del área lesionada.

9.3.2.6 Fenol oxidasas

Estas enzimas catalizan las reacciones de oxigenación de los fenoles vegetales. Las fenol oxidasas son abundantes en las paredes celulares pero también están localizadas en las membranas tilacoidales de los cloroplastos, donde ellas son presumiblemente requeridas para la síntesis de plastocianina, un constituyente de la cadena fotosintética de transporte de e^- (Sección 5.2.1). Estas enzimas tienen dos notables funciones: (a) ellas hidroxilan monofenoles a difenoles, semejándose a, por ejemplo, la actividad tirosinasa, y (b) ellas oxidan difenoles a o-quinonas, por ejemplo, semejándose a la actividad dihidroxifenilalanina (DOPA) oxidasa:

Ambas reacciones necesitan oxigeno molecular. Están acopladas entre ellas, si los monofenoles son los sustratos. Ellas son llamadas de acuerdo a su mas importante sustrato como monofenol oxidasas, polifenol oxidasas, fenolasas, DOPA oxidasas, tirosinasas, etc. Su especificidad es bastante baja.

Las polifenol oxidasas están involucradas en la biosíntesis de lignina (ver Sección 9.3.4) y alcaloides y en la formación de sustancias melanóticas marronas, que se forman algunas veces cuando se lesionan los tejidos (e.g., en manzana y papa). Estas sustancias son también activas como fitoalexinas, que inhiben la germinación de esporas y el crecimiento fungoso. Bajo deficiencia de cobre, es bastante severa la disminución de la actividad polifenol oxidasa (Tabla 9.12) y está correlacionada con una acumulación de fenólicos y una disminución en la formación de sustancias melanóticas. El último efecto se refleja, por ejemplo, en la estrecha correlación entre el color de las esporas de Aspergillus niger y el estado nutricional del cobre. Con un amplio suministro de cobre las esporas son negras; con deficiencia suave ellas son marrón claro; y con deficiencia severa ellas son blancas.

La actividad polifenol oxidasa es casi ausente en hojas deficientes de cobre de trébol subterráneo o soya. En esta ultima especie hay una relación casi lineal entre la actividad polifenol oxidasa y el suministro de cobre. La actividad polifenol oxidasa en hojas de soya solo es disminuida por la deficiencia de cobre y no por cualquier otro micronutriente deficiente. 

Una declinación en la actividad polifenol oxidasa con la deficiencia de cobre puede ser por lo menos indirectamente responsable del retraso en la floración y maduración frecuentemente observados en plantas deficientes de cobre y es mostrado para el florecimiento de Chrysanthemum en la Tabla 9.12. La deficiencia de cobre conduce a una disminución en el número de vástagos floridos, pero principalmente impide la apertura floral. Como se esperaría, la actividad polifenol oxidasa fue mucho menor en plantas deficientes en cobre, pero las actividades de la IAA-oxidasa y peroxidasa fueron también menores. Por otro lado, en cultivo de tejidos frecuentemente se deteriora severamente la regeneración vegetal por las altas actividades de la polifenol oxidasa. Por consiguiente, el porcentaje de explantes que regeneren vástagos está inversamente correlacionado con el contenido de cobre en las plantas stock, y los mejores resultados en la regeneración son conseguidos con explantes de plantas stock severamente deficientes en cobre.

9.3.3 Carbohidratos, lípidos y metabolismo del nitrógeno

En plantas que sufren de deficiencia de cobre el contenido de carbohidratos solubles es considerablemente menor que el normal durante la etapa vegetativa. Sin embargo, después de la antesis, cuando los granos se han desarrollado como una demanda dominante, las plantas deficientes de cobre solo tienen unos pocos granos (Sección 6.3.3), permanecen verdes (i.e., activamente fotosintetizadoras) y acumulan altos contenidos de carbohidratos solubles en las hojas y raíces (Fig. 9.11). Las hojas de plantas deficientes pueden aún liberar gotas de sustancias como mielecilla.

Fig. 9.11 Concentraciones de carbohidratos solubles en hojas bandera (A) y raíces (B) en plantas de trigo cultivadas a dos niveles de cobre en función de la edad vegetal. Clave: ●, +Cu; ○, -Cu. (Modificado a partir de Graham., 1980a)

En vista del rol del cobre en el PS I se esperan bajas tasas de fotosíntesis y bajos contenidos de carbohidratos, por lo menos durante la etapa vegetativa. Sin embargo, en plantas con severa deficiencia de cobre la caída en la fijación neta de CO₂ a cerca del 50% expresada ambos en términos de unidad de clorofila ó de área foliar no puede ser atribuida solamente a la mucha menor actividad del PS I. También debe ser un factor que contribuye la menor actividad del PS II, probablemente debido a la deteriorada síntesis de carotenoides en el PS II, de quinonas, y a la desintegración de las membranas tilacoidales. En plantas suficientes de cobre se localizan 11 átomos de cobre por 1000 moléculas de clorofila en el complejo PS II. Bajo severa deficiencia de cobre se presentan alteraciones en los polipéptidos del PS II y la composición lipídica cambia a favor de los ácidos grasos menos insaturados, por ejemplo, 18:3 → 18:2. Estos cambios en la composición de los ácidos grasos en los tilacoides y en el complejo PS II están probablemente relacionados con las funciones del cobre en la insaturación de los ácidos grasos de cadena larga (e.g., 18:2 → 18:3). Otra proteína de Cu, la oxidasa alternativa en los glioxisomas está involucrada en esta insaturación.

El bajo contenido de carbohidratos en plantas deficientes de cobre está involucrado en la deteriorada formación del polen y fertilización (Sección 9.3.5), y es ciertamente la principal razón de la deprimida nodulación y fijación de N₂ en leguminosas deficientes de cobre. Se presentan síntomas de deficiencia de nitrógeno que pueden ser superados mediante la aplicación de nitrógeno mineral. En plantas no leguminosas deficientes en cobre el contenido proteico puede ser algo inferior ó similar (Tabla 9.11) ó aún superior que en plantas suficientes en cobre. En algunos casos también hay una acumulación de aminoácidos y nitrato en plantas deficientes. Se carece de evidencia, sin embargo, el cobre está involucrado directamente en la biosíntesis de proteínas, fuera de las proteínas que contienen cobre (Sección 9.3.2.4 y 9.3.2.5).

Se ha mostrado repetidamente que la aplicación de nitrógeno acentúa la deficiencia de cobre, y cuando el suministro de nitrógeno es alto, se requiere la aplicación de fertilizantes de cobre para el máximo rendimiento. Además de las interacciones no específicas (e.g., crecimiento realzado por el nitrógeno), el nitrógeno tiene efectos específicos en la disponibilidad y movilidad del cobre, incluyendo (a) el secuestro de una gran proporción del cobre complejado a aminoácidos y proteínas en tejidos maduros y (b) una disminución en la tasa de retranslocación de cobre desde las hojas mas viejas a áreas de nuevo crecimiento. La retranslocación del cobre está estrechamente relacionada a la senescencia foliar (Sección 3.5). Debido a que el alto suministro de nitrógeno retrasa la senescencia, este también retrasa la retranslocación del cobre. La deteriorada retranslocación del cobre hacia los nuevos crecimientos está también involucrada en la deficiencia de cobre (deformaciones caulinares) en poblaciones de Pinus radiata establecidas sobre praderas fértiles. De acuerdo con esto, los niveles críticos de deficiencia del cobre en la materia seca del vástago entero requeridos para el máximo crecimiento se incrementan con el creciente suministro de nitrógeno.

9.3.4 Lignificación

La deteriorada lignificación de las paredes celulares es el más típico cambio anatómico inducido por la deficiencia de cobre en plantas superiores. Esto da origen a la característica distorsión de las hojas jóvenes, encorvamiento y retorcimiento de los tallos y ramas (deformación del tallo y formas “pendulares” en los árboles) y a un incremento en la susceptibilidad al volcamiento de cereales, particularmente en combinación con un alto suministro de nitrógeno.

Como se mostró en la Tabla 9.13 el cobre tiene un marcado efecto en la formación y composición química de las paredes celulares. En hojas deficientes disminuye la proporción del material pared celular a materia seca total; simultáneamente se incrementa la proporción de α-celulosa mientras que el contenido de lignina solo es aproximadamente la mitad de aquel en hojas adecuadamente suplidas con cobre. Este efecto en la lignificación es aún más notable en las células esclerenquimáticas del tejido caulinar (Fig. 9.12). En plantas que sufren de deficiencia severa de cobre los vasos del xilema están también insuficientemente lignificados. Con una suave deficiencia de cobre aún se presenta una disminución en la lignificación y es de esta manera un indicador conveniente del estado nutricional del cobre de una planta.

La lignificación responde rápidamente al suministro de cobre; los periodos transitorios de deficiencia de cobre durante el periodo de crecimiento pueden ser rápidamente identificados por las variaciones en el grado de lignificación en secciones del tallo.

La inhibición de la lignificación en tejido deficiente de cobre está relacionada con el rol directo de por lo menos dos enzimas de cobre en la biosíntesis de lignina. La polifenol oxidasa cataliza la oxidación de los fenólicos como precursores de la lignina, y la diamina oxidasa proporciona el H₂O₂ requerido para la oxidación por las peroxidasas. Por consiguiente, en tejidos deficientes de cobre no solo disminuye la actividad de ambas enzimas sino que también se acumulan los fenólicos (Tabla 9.13).

Fig. 9.12 Secciones caulinares de plantas de girasol cultivadas con suministro suficiente de cobre (50 μg Cu l^-1) y sin suministro de cobre. (Arriba) Suficiente en cobre; las paredes de las células esclerenquimáticas son gruesas y lignificadas. (Abajo) Deficiente en cobre; las paredes de las células esclerenquimáticas son delgadas y no lignificadas. (Rahimi & Bussler, 1974)

9.3.5 Formación del Polen y Fertilización

La deficiencia de cobre afecta mucho mas la formación del grano, semilla, y fruto que el crecimiento vegetativo (ver también Sección 6.3.3). Se muestra un ejemplo típico en la Tabla 9.14. El suministro de 0.5 μg cobre produjo el máximo rendimiento materia seca radical y caulinar pero se deterioro la formación de flores, y no se formaron frutos. Para la formación del fruto se requirió un mucho mayor suministro de cobre. La declinación en los pesos secos radical, foliar y caulinar con un suministro de 1.0 y 5.0 μg cobre refleja la competición entre demandas (Sección 5.7). Con un suministro de 10 μg se presento toxicidad.